[目的]研究维生素C对4°C西北克什米尔山羊精子及其全酶组织甲基化，DNA甲基化的影响，为有效利用奠定基础。藏山羊高粱精子及其人工授精技术。[方法]在藏麂皮人工公羊收集并用维生素B12稀释加入不同浓度的维生素C（0，2.0，4.0，6.0，8.0的人造阴道精液，10 ，0和12.0毫克/毫升）。4℃下储存24小时后，观察到精子活力，顶体和精子完整性和质膜完整性，并观察到全基因组精子DNA的甲基化。过定量荧光实时PCR检测。[结果]在克什米尔西北部山羊4°C，4°C储存后，添加8.0 mg / mL维生素C效果最佳。移率，冷库建造顶体/精子完整性和质膜完整性为（73.41±0.47）。％，（58.89±0.88）％和（68.76±0.81）％，三项指标均显着高于不含维生素C的白对照组（P <0.01）。
　　藏西北部克什米尔山羊精子基因组DNA甲基化水平8.0 mg / mL维生素C显着低于新鲜精子，显着低于非维生素C （P <0.05）。【结论】原始精子中添加2.0 mg / mL维生素C可降低优质藏山羊4℃全基因组DNA异常甲基化水平，提高效果。藏藏山羊精子冷藏。键词：西藏西北部绒山羊;精液;维生素C;制冷; DNA甲基化分类号：S826.83文献代码：A文章编号：1195至91年（2017年）02-0357-04Résumé：【目的】本研究的维生素C对精子的影响西北克什米尔山羊保存在4°C并完成基因组DNA的甲基化水平，以便为使用ram精子和促进人工授精技术奠定基础。来。藏西北部的绒山羊新鲜精子采用人工阴道收集，然后采用不同浓度的维生素C（0，2，0，4，0，6，0，8，0）向维生素B12稀释4倍的精子中加入10.0和12.0 mg / ml，并在4°C保存24小时。子活力，顶体完整性和质膜完整性观察到并通过实时定量PCR检测基因组DNA的完全甲基化。
　　[结果]西藏西北部的克什米尔山羊精子质量最佳，4℃保存24小时，维生素C 8.0 mg / ml。
　　子活力为（73.41±0） ，47）％，顶体完整性（58.89±0.88）％和质膜完整性（68.76±0.81）％。此同时三个指数，精子的完整基因组的DNA甲基化水平是相似的新鲜精液，并且比没有添加维生素C的精子的显著下（在同一时间，甲基化水平的整个精子基因组DNA与新鲜精子接近，明显低于不加任何维生素C的精子（P <0.01）P <0.05）。[结论]西藏西北部4℃贮藏的绒山羊精液中添加2.0 mg / mL维生素C可降低DNA甲基化水平，提高精子质量。存在制冷温度下关键词：西藏西北部的绒山羊种子;维生素C;制冷; DNA甲基化介绍山羊克什米尔藏西北，又称克什米尔山羊（Yishiduoji等，2009）研究的重要性]，是完全适应了高海拔地区（西藏北西），缺氧，无霜期短，温差大，全年无食物自然条件，并提供14.5±0.5μm的羊绒精细，除了绒山羊（Suolang Da et al。

　　2015）。年来，随着重点建设项目的启动，如农业和畜牧业的特色西藏产业和家禽养殖项目，国家对牲畜种子的补贴家禽和其他支持政策一个接一个地实施。效使用山羊公羊也是备受关注的主题。[以往研究进展]维生素C是一种重要且有效的自由基清除剂，具有高还原性。

　　参与生物体内的氧化还原反应，在保护家畜和家禽精子方面发挥着重要作用（Jones and Mann 1977，Zhao Xianlin 2009）。Singh等（1996）在冷冻牛提取物中添加了25 mmol / L的维生素C，这使得解冻后精子的血清从37.5％显着增加到46.0％。Aurich等（1997）将0.9 mg / mL的维生素C添加到马精液中，发现它抑制精子代谢并延长生存期。Sánchez-Partida等。（1997）在冷冻羊提取物中加入50至100 mmol / L的维生素C.结果表明，解冻后精子代谢减少，生存时间延长，因为维生素C实际上可以防止精子中磷脂的形成。氧化保护精子免受自由基的侵害。仙林（2009）在牛精子稀释液中添加了6.0 mg / mL的维生素C，发现解冻后0小时的精子活力与新鲜精液没有显着差异。明维生素C的浓度与注射幅度和冷冻精液的搅打频率有关。

　　响不明显。宗明等（2012）表明，添加3.0 mg / mL维生素C可显着提高贵州黑山羊精液在4℃时的保鲜效果。子华等（2014）发现在德宝矮化精液冷冻稀释液中添加维生素C可以有效延长体外精子的存活时间。Yang Bo等（2014）发现，在兔子精液稀释液中加入维生素C可以提高室温下储存的精子质量。力仁和其同事（2016）表明，添加维生素C精子稀释可以降低DNA甲基化的异常水平在藏猪精子和改善藏猪精液4的保护C. [本研究的切入点]长期以来，由于精子活力和解冻山羊后低生育率等因素，促进和大规模应用冷冻精子山羊受到严重限制。低温下，液态山羊精液具有较低的代谢率并且具有比常温更长的保质期。可以储存在4°C的普通冰箱中，既经济又实用。此，液体精子冷冻保存系统的后续优化对于提高山羊公羊的利用率和促进其人工授精技术具有重要意义。[密钥解决的问题]在24℃下基于维生素B12不同浓度的维生素C添加到稀释4倍，西北绒山羊tibétain.Après存储的24个小时，观察活动力，所述精子的完整性和质量。完整率探讨了维生素C对西藏西北部绒山羊精液冷却效果的影响，并通过定量精子PCR时间检测基因组DNA的甲基化。实的，为了使用藏羊精子，促进其人工使用。
　　精技术奠定了基础。料和方法1种材料测试的测试压头是绒山羊西北藏健康，年龄3至5年，共9种公羊，人造阴道人工收集他们的新鲜精液稀释，并用4倍人体维生素B12。释后，将精子在8℃的培养皿中在18℃的培养箱中包裹2小时，然后在4℃下储存24小时。生素C是在上海买的。代哈森（商丘）药业有限公司，辉煌的蓝色考马斯，R 250购自上海展云化工有限公司。Diff-Quik染色染料溶液购自Beijing Pubos Biotechnology Co.，Ltd。试剂盒购自北京Biosmart Biotech有限公司。自美国Epigentek的MethyFlashTM（比色）Methyl DNA Quantization Kit。要设备：倒置荧光显微镜（IX73，奥林巴斯），电恒温水箱（DKB-450A，上海实验仪器森信），冰箱逆变器（BCD-649WDVC，海尔），电加热恒温槽DK-S28 -Marie（上海景洪），UV-1100紫外可见分光光度计（上海美达仪器有限公司），高速离心机低温Multifuge X3和吸收酶标仪ELx808（美国）。2实验模型2. 1维生素C对西藏西北部绒山羊4℃时精子质量的影响添加不同浓度的维生素C（0，2.0，4.0，6.0， 8.0）西藏西北部克什米尔山羊精液中四倍稀释的维生素B12。4℃下研究24小时后，观察到精子活力，精子顶体完整性和质膜完整性。充维生素C对精子质量的影响在4°C时检查了西藏西北部的克什米尔山羊。复3次。2. 2维生素C对西藏西北克什米尔山羊奶在4°C时全基因组DNA甲基化的影响根据1.2.1节，维生素C（A）的最佳浓度为选择并添加新鲜种子组（B）。生素C组（C）。过实时定量PCR检测不同处理组中整个精子基因组的DNA甲基化，以及维生素C对北克什米尔山羊精子DNA甲基化的影响 - 已经研究了4°C的西部。

　　复3次。3点和通过以下方法确定3. 1精子顶体完整率精子率和精子活力的质膜测定常规功能完整性的运动功能的方法林佳蓬等人（2015） Tang Shuhong等（2015），精子顶体完整率用Hu Chuanhuo等（2015）的方法评价质膜的完整性。3.2检测精子基因组DNA的甲基化水平用精子基因组DNA提取试剂盒从不同处理组中提取精子基因组DNA，其浓度和纯度均为用UV-1100紫外 - 可见分光光度计检测琼脂糖凝胶电泳。查波段的清晰度和对齐情况。时，标准曲线被设计通过参照DNA定量试剂盒甲基MethyFlashTM（颜色）来计算山羊精液的DNA甲基化水平采样克什米尔西北藏。4统计分析实验数据在Excel 2010中进行分类，然后使用SPSS 11.5进行单向ANOVA分析和Duncan多重比较。克什米尔山羊精液西北藏的保护结果与分析1效应的维生素C在4℃由表1可知西北克什米尔山羊的精子保持在24° C，并添加来自维生素C治疗组的运动性和顶体精子。膜的完整性和完整性高于空白对照组，并且随着维生素C浓度的增加，精子活力，精子的顶体完整率增加。膜完整率先上升后下降。中，添加8.0 mg / mL维生素C的效果最好，流动性，顶体/精子完整率和质膜完整性分别为（73.41±0.47）％，（58.89±0.88）和（68.76±0.81）。％，3个指标显着高于不含维生素C的白色对照组（P <0.01）。
　　2 DNA的纯度的结果测试绒山羊精子的基因组藏西北通过紫外可见分光光度计UV-1100检测以确定维生素C的最佳浓度（8.0毫克/毫升）（a）中，精子新鲜（B）和缺乏维生素C.克什米尔山羊组（C）西北的精子的整个基因组的DNA表明的全基因组DNA浓度西北克什米尔山羊为325±10 ng /μL，纯度为1.9-2.0，琼脂糖DNA凝胶干净整洁。单（图1）。待检查的山羊克什米尔精子的整个基因组DNA稀释至100ng /μL并使用。生素C对精子的基因组DNA的西北甲基化绒山羊3. 1标准曲线的制备在参考DNA定量试剂盒甲基MethyFlashTM（比色），5- 3的影响（图2）甲基胞嘧啶（5-MC，50％）的标准曲线绘制在纵坐标，横坐标和荧光单位，并且获得回归方程，通过调整为：y = 128 + 1127，6x ，8（R2 = 0.9978）。图2所示，调整后的回归方程具有良好的线性关系，可用于计算DNA的5 mC含量和甲基化水平。3.2维生素C对西藏绒山羊西北部基因组精子DNA甲基化水平的影响组（A）中维生素C浓度最高（8.0 mg / mL） ，新鲜种子组（B）和维生素C组（C）C组DNA甲基化水平最高，显着高于A组和B组（p < 0.05）。B组之间的差异不显着（p> 0.05）。报道，加入8.0毫克/维生素C毫升可有效降低在克什米尔西北的山羊上精子的DNA甲基化的低温（4℃）的效果并改善克什米尔地区藏山羊的低温制冷。
　　论本研究结果表明，添加维生素C，精子活力，精子顶体完整性和山羊精液质膜完整性增加西藏西北部的储存在4°C的西藏西北部首先增加然后减少（比较）。中，添加8.0 mg / mL维生素C的效果最好，流动性，顶体/精子完整率和质膜完整性分别为（73.41±0.47）％，（58.89±0.88）和（68.76±0.81）。％，3个指标极显着高于其他治疗组。添加维生素C之前，用维生素B12将该研究稀释4倍，这相当于原始精子中2.0mg / mL的最佳添加维生素C，然后是3，陈宗明等人用原始精子给予0 mg / mL维生素Z. C可以显着提高贵州黑山羊种子在4℃下对云贵高原的冷害效果。1.0 mg / mL的差异可能与大气氧，氧含量，环境湿度和冷冻产生的其他活性氧有关，但原因不在具体要求需要进一步研究。Benchaib等人，（2005）通过流式细胞术flux.Il通过免疫组织化学染色和定量分析人精子已经发现，在AHR精子的基因组DNA甲基化水平可以用于确定是否人类精子有能力受孕。方法。精子DNA的片段化与全基因组DNA的甲基化之间存在负相关，添加抗氧化剂可减少对DNA的损伤并确保正常的精子甲基化状态（Tunc和Tremellen，2009年）。

　　研究结果表明，添加8.0 mg / mL的维生素C可以有效降低低温（4°C）保存对整个甲基化基因组的影响。北藏山羊精子DNA和提高山羊中国精子的低温寒冷效应。等（2016）维生素C西藏猪精液稀释添加可以减少藏猪精子的DNA甲基化的异常水平和改善藏猪精液的养护在4℃下它被指示维生素C对西北克什米尔山羊的整个基因组的DNA，其可以消除制冷产生的自由基强还原性（琼斯和Mann，1977;赵仙林，2009），并且可以实际防止精子磷脂的过氧化和基因组DNA的甲基化水平保护精子免受自由基损伤。论加入2.0毫克/维生素C与原始精子毫升可在4℃下在降低的全基因组藏山羊高质量DNA甲基化的异常水平，以提高的效果西藏藏山羊精子冷藏。
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