摘要：热应激可诱导热休克蛋白的表达，热休克处理可减轻果实冷却引起的损伤。了研究热胁迫下香蕉热休克蛋白基因表达的调控及香蕉热休克蛋白基因表达与冷却后病变的关系。过同源序列方法分离香蕉皮的HSP70基因序列。计引物，以香蕉皮总RNA为模板，通过RT-PCR克隆HSP70香蕉cDNA，不同贮藏温度下的基因表达特征为通过Northern杂交分析。

　　结果是，获得了不同的序列的HSP70基因的两个片段，马某-MA-HSP70-1和HSP70-2，和Ma和麻HSP70-1 HSP70-2之间基本的同源性为86， 9％。源性为97.1％。Northern杂交结果显示，38℃的短期热休克处理诱导Ma-HSP70-2基因表达，并且低温冷冻增强了两种基因的表达。认为Ma-HSP70可能与香蕉的耐寒性有关。蕉; HSP70; cDNA克隆;序列分析; Northern印迹数CLC：S668.1文献代码：A文章编号：1009-9980（2012）在香蕉存储果皮HSP70两种cDNA片段的02-0241-05Clonage和表达分析高低温何利hong1，2，陈建YE2，冷库安装王海LAN2，匡建飞2，潞王jin2 *摘要：很多证据表明，压力由于温度引起的蛋白质热休克在当前处理中，使用基于同源性的方法从香蕉皮中克隆两个HSP70片段，以研究它们的热应激表达及它们之间的关系。情和冷伤。参考设计为已知的HSP70的保守氨基酸序列的简并PCR引物，香蕉皮RNA的总提取物作为模板和HSP70 cDNA片段通过RT-PCR，以扩增以通过Northern杂交研究它们在不同环境中的表达特征。隆了两种不同的cDNA片段，命名为Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2。

　　个HSP70之间的同源性是核苷酸序列的86.9％。基酸序列水平和97.1％使用Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2作为探针，Northern杂交显示短期热预处理（38°C）不诱导成绩单马HSP70-2的表达，然而，HSP70基因2的低温贮存提高马HSP70对香蕉抗寒性的影响。键词：香蕉; HSP70; cDNA克隆;序列; Northern杂交体形成的热休克蛋白（HSP）经受高温或其他应力的一个特殊的基团，并且有许多从植物类型HSP的，根据质量的分割尺寸HSP在：HSP100，HSP90，HSP70，HSP60和低分子量热休克的smHSP蛋白。休克蛋白具有耐热性，分子伴侣和有助于异常蛋白质分解的功能，以保护细胞免受进一步损害[1-2]。过去的十年中，许多热休克蛋白的基因已经从植物中分离：基因库，矮牵牛，水稻，冬瓜，绿豆，番茄，烟草，小海芥菜，黄瓜，玉米，菠菜，紫花苜蓿，拟南芥，油菜，豌豆和大豆等植物的热休克蛋白基因。

　　
　　蕉是中国南方的主要水果之一，低温贮藏可以延长香蕉的保质期。而，香蕉对低温非常敏感，对冷的敏感性低于11℃。究表明，热处理可以提高桂花和其他水果的耐寒性[3]。们的研究还表明，38°C的热处理也可以提高香蕉的耐寒性[4]，但热休克蛋白在香蕉耐寒性中的作用。究？因此，对香蕉果实热休克蛋白基因的分离和克隆及其表达特征的分析具有重要的理论意义和应用价值，可用于分析其关系。休克蛋白与其基因之间的差异以及香蕉的贮藏技术和耐寒性的改善。来越多的研究表明植物中的交叉适应：对具有中等压力的植物进行处理不仅会诱发抗逆性，还会增加对其他胁迫的耐受性。如，热预处理会诱导桂花，胶囊，葡萄和鳄梨的抗寒性[5];短期热处理（例如，62℃，20秒）改善皮肤HSP18柚子-1，HSP22和HSP70基因HSP18-II的表达，以及这些基因被持续表达到处理随后的冷藏，在低温下具有改善的耐受性[6];在38℃的热处理诱导HSP70葡萄浆果和在低温下获得的果实的表达耐心[5]。们使用RT-PCR来克隆基因HSP70香蕉和通过Northern杂交，从而奠定了全面的研究的基础上的分析热加工和冷冻保存过程中的基因表达特征不同分子量的热休克蛋白和香蕉耐冷性的机制。料和方法材料香蕉品种（Musa AAA group，cv.Brazil）购自广东省番禺香蕉园。
　　获的香蕉手指已满7-80％，并在果园中装满了盒子。验室。每个精梳香蕉分成单个香蕉指后，选择没有疾病，昆虫和受伤果实的均匀果实，并用500mg·L-1处理以提取和干燥。香蕉包裹在聚乙烯薄膜袋中并储存在相应的培养箱（MT-533培养箱，Sanyo，Japan）中。存条件如下：在室温下储存（22℃），热处理（38℃）和存储在低温（8℃）储存和热处理在室温下第一采样的水果和存储的第二天分别。察到冷却症状，并在第三天对在低温下储存的水果进行取样。当服用10片香蕉时，将皮肤和果肉分离，在液氮中冷冻并储存在-80℃直至使用。取和分离从总RNA提取的总RNA的方法是热硼酸方法，其根据Wan等人的方法进行。
　　[7]。物设计和合成基于已知并存储在GeneBank中的HSP70基因的保守氨基酸序列设计引物。于克隆的HSP70 cDNA片段，在其3'末端设计引物，然后在3'末端延伸HSP70 cDNA片段。引物示于表1由上海生工，生物工程有限公司的cDNA的克隆和序列分析的香蕉皮的总RNA的技术部合成出作为底物用于逆转录单链cDNA，和单链cDNA用作用于简并引物的模板简并基因HSP70（热休克蛋白70 - UP1和HSP70-DW1）。PCR扩增条件为：94℃3分钟，1个循环，然后35个循环（94℃1分钟，61℃2分钟，72℃2分钟），一旦循环完成后，再延长至72°C再保持10分钟。所述RT-PCR产物在1％琼脂糖进行电泳后，目标片段切下并纯化和纯化后，将其用pMD18-T载体（TaKaRa公司，志贺，日本），并连接转化入DH5α感受态细胞（TaKaRa，Shiga，Japan）。选阳性克隆在LB平板上/ AMP / IPTG / X-Gal的，然后插入质粒通过双击的EcoRI / HindIII位消化（TaKaRa公司，志贺，日本）进行序列分析证实。序工作由上海英俊生物技术有限公司使用ABI377序列分析仪（美国）委托。Northern印迹（转移）RNA的10微克进行在含有1.2％甲醛的琼脂糖凝胶变性凝胶电泳（电泳条件：50 V，60分钟），电泳后，在2x SSC的解决方案。次在室温下浸泡两次，每次20分钟。
　　用20×SSC的上行毛细管转移法作为转移缓冲液，将变性的RNA从凝胶转移到尼龙膜（BiodyneB0.45μm，PALL）上。移16至20小时后，将尼龙膜在80℃下烧制。UV固化后，将其储存在4℃的冰箱中使用。针质粒DNA的制备物进行碱处理，并使用合成试剂盒PCR DIG探针（罗氏应用科学，曼海姆，德国）合成DIG标记的DNA探针。成探针Ma-HSP70-1上游的引物序列为5'。-TGAACCCCATCAACACCGTC-3'，下游引物序列为5'-CCTCA AAGATACCCTCCTCGG-3';合成探针马HSP70-2的上游引物的序列是ATGAACCCAACCAACACCGT 5'-3”，下游引物序列是5'-GACCATAGCAgACA 3' 探针合成的具体方法描述于说明书（Roche Applied Science，Mannheim，Germany）。过Northern杂交，在45℃相关的RNA用于在杂交腔室含有下列组分3个小时尼龙膜预杂交：50％甲酰胺的去离子，5×SSC，7％SDS，2％的阻断，50 mmol磷酸钠缓冲液L-1（pH7.0）和十二烷基肌氨酸钠0.1％（w / v）。杂交，预杂交溶液倾析后，加入地高辛标记的探针和杂交在45℃下在杂交箱过夜进行杂交后，将膜尼龙用2×SSC（含0.1％SDS）冲洗两次，每次10分钟。
　　膜在62℃的膜缀合的抗体 - 抗原用含0.1×SSC中（含有0.1％SDS）洗涤两次吐温20，以除去未结合的抗体，然后CDP-StarTM已用于化学发光。原理检测杂交信号的强度。果和分析RT-PCR产物的扩增采用RT-PCR扩增，以获得对应于目标片段的大小，将其连接到载体PMD 18-T，并通过双消化的EcoR确认了910 bp的条带我/ HindIII。入片段（图1）。列分析和同源性比较在质粒中获得了不同序列的HSP70基因的两个片段。
　　段长度为916个碱基，编码304个氨基酸，分别命名为Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2（序列未列出）。Ma-HSP70中分别克隆Ma-HSP70 cDNA的完整序列。异性引物，设计为在片段-1和麻HSP70-2（引物序列示于表1至麻HSP70-1-UP1和麻HSP70-2-UP1）和简并引物设计了（参见表1中的HSP70-Dw2）。后，在下游扩增186个氨基酸，并扩增编码Ma-HSP70的490个氨基酸的总共1473个碱基。
　　个片段之间的碱基同源性为86.9％，氨基酸同源性为97.1％（图2）。Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2基因在室温，热休克和冷藏条件下在香蕉皮中的表达。1℃下的热休克处理对Ma-HSP70-1基因的表达几乎没有影响，在38℃下进行热休克处理。蕉皮的表达信号是类似于香蕉皮储存在22℃下1天，2天后，表明该基因被连续表达HSP70-1，即使它没有被诱导的高温下。在8℃下，基因的表达低温处理3天后麻HSP70-2被显著增加，可知该基因麻HSP70-2的表达是低的温度敏感（图3）。

　　休克处理1天对Ma-HSP70-2基因表达影响不大，表达信号在38℃热胁迫处理2天后增强;这已被回收并储存在22℃下1天2天在室温下表达的信号强度的香蕉皮是可比，表明该基因麻HSP70-2也有人没有压力，但比Ma-HSP70-1基因弱。在8℃下，基因的表达低温处理3天后麻HSP70-2被显著增加，并且它显露该基因的表达马氏HSP70-2诱导的高，低温（图3）。讨论的年Ritossa [8]发现在果蝇幼虫的热休克反应，并于1974年，Tissieres等人[9]已经分离出热激蛋白70和26区和逐渐扩展到细菌，酵母，植物，哺乳动物和人类。发现热休克蛋白在生物体中无处不在。休克蛋白不仅由高温引起的，但各种物理和化学因素损害细胞可诱导热休克蛋白（疾病，营养缺乏，紫外线辐射，干旱，盐，寒冷，重金属和氧化应激）。

　　中，HSP70家族的成员广泛分布于细胞的各种部位，如细胞核，细胞质，内质网，线粒体和叶绿体，它们是高度保守的和HSP70真核和大肠杆菌的同源性HSP70是大于65％10在该实验中HSP70基因克隆香蕉皮的两个片段之间的基本同源性为86.9％，并且氨基酸同源性为97.1％，再次确认HSP70系列的高保护性。些HSP在生物体被组成型表达并在细胞周期的特定阶段，或者在生物体的某些发育阶段也表示在未刺激的细胞，用作持家基因[11]。实验表明，在38℃的短期热激处理，以诱导基因表达马氏HSP70-2但对基因表达的麻HSP70-1，基因影响不大Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2不受任何热应激。有一种表达，Ma-HSP70-1比Ma-HSP70-2基因更有效。表明，虽然基因马-MA-HSP70-2 HSP70-1和组成型表达，高温短期可诱发马氏HSP70-2的表达。研究表明，植物中存在交叉适应[5-6]，Collins等[12]认为耐寒性与HSP之间存在直接关系。项研究表明，在8℃下冷藏显著增加两个基因的表达，这表明麻HSP70-1诱导低温，麻HSP70-2诱导型到低温和高温的时间。外，Ma-HSP70-2基因在低温下的诱导强于高温诱导的基因。HSP70是主要的分子伴侣，分布广泛，细胞丰富。正常和压力条件下，HSP70具有防止新合成蛋白质积累和参与新合成蛋白质折叠的作用[13]。有机体暴露于环境压力下并且可能参与新合成蛋白质的折叠和水解时，该家族的一些成员被表达[14]。们的结果表明，基因表达HSP70-2马诱导短期热激处理在38℃和基因和马-MA-HSP70-1 HSP70-2的表达被诱导在8℃冷藏.HSP70的表达可以维持细胞内环境。定保护细胞免受进一步损害。论简并引物是根据已知并存储在GeneBank中的HSP70基因的保守氨基酸序列设计的。增HSP70基因的cDNA，得到不同序列的HSP70基因的两个片段。个HSP70基因片段的碱基同源性为86.9％，氨基酸同源性为97.1％。用两个HSP70基因进行Northern杂交。果表明，38℃的短期热休克处理诱导了Ma-HSP70-2基因的表达，冷藏诱导了两个基因的表达。
　　Ma-HSP70可能在香蕉温度的压力中发挥作用。
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