在本文中，发酵乳杆菌grx08，干酪乳杆菌和grx12鼠李糖乳杆菌LV108用作实验菌株，以确定在发酵性能的变化，关键代谢酶和细胞膜的前，并在真空冻干后的渗透性。果表明，冷冻干燥，凝乳时间延长后，粘度值下降，凝乳的酸度，pH值没有太大变化的细胞存活率下降。
　　细胞代谢，β半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶关键酶的活性，都是冻干冻干后之前受损，乳酸菌的细胞内Ca 2 浓度增加了。冻干燥后，细胞膜的完整性被破坏，细胞膜的渗透性增加，冷库安装这可能是导致发酵性能变化的关键因素。空冷冻干燥;发酵特性;酶活性;细胞膜摘要渗透性：是发酵乳杆菌grx08，干酪乳杆菌grx12，鼠李糖乳杆菌LV108作为试验菌株，测定发酵的特性，代谢酶和膜渗透性生存率的结果细胞数减少，凝乳时间延长，粘度指数降低，但凝乳后酸度和pH值几乎没有变化。括β-半乳糖苷酶和LDH在内的关键代谢酶的活性已经降低。坏细胞膜的完整性和细胞膜通透性的增加可能是改变发酵特性的关键因素之一。
　　键词：真空冻干;发酵特性;酶活性;细胞膜分类中图分类号：TS201.3乳酸菌通常用于食品工业中，用于生产益生菌或引发剂。酸奶等发酵产品的生产中，该产品影响产品的感官品质和质量。菌株是在生产过程中热刺激和传统的起始产品的生产敏感需要多个激活和扩展，这个过程是繁琐的，并且不能满足工业需求迅速增长。此，通常使用冻干和真空储存来制备非常有效的起始材料。种方式。空冷冻干燥（称为“冷冻干燥”）涉及冷冻该细菌悬浮液在下面的三相点的低温环境，然后抽吸细胞内和细胞外的游离水，以形成处于冷冻状态的气体以消除水分。标[1]。菌不进入在低温下与空气接触而失去的水，可有效地防止劣化由于微生物活性和蛋白质变性，并有效地延长细菌的保存期乳酸。而，冷冻干燥过程不可避免地导致机械损伤，细胞膜损伤甚至一些菌株的死亡。据的研究小组研究的基础上，本文检查发酵乳杆菌grx08，干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌grx12 Hsryfm 1301的存活率和发酵特性和前和冻干后确定乳酸菌的新陈代谢。渗透性酶和细胞膜的变化进行了分析，并在乳酸菌真空冷冻，其用作用于在其保护机制进一步研究的基础的生理损伤的机制。料与方法实验菌株发酵乳杆菌grx08，干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌LV108 grx12都是分离和生物技术的控制实验室和江苏乳制品的安全存储。要试剂和主要试剂，2-硝基苯-β-D-半乳糖苷（ONPG）生物工程有限公司; Fluo3-AM荧光探针，Sigma，USA;其他试剂由Sinopharm Group Pur分析。等，MRS培养基（固体/液体），脱脂乳培养基。器设备酶标仪生物TCK ELX 800，美国社会的宝特，高速冷冻离心机5804R，德国EPPENDORF公司;真空冷冻干燥机RLPHR1-2LD，德国Wertheim公司;超声波细胞喷雾器，宁波新智生物科技有限公司; PE-20 pH计，梅特勒 - 托利多仪器有限公司活化方法的乳酸菌冷冻实验菌株中在-80℃冰箱中放置在MRS液体培养基中，在37℃下24小时的革兰氏染色的显微细菌进行。确认不存在细菌后，将所有三个活化的世代用于后续实验。空冷冻 - 冷冻干燥根据文献中描述的蔡晶晶[2]的方法收集细菌，制备细菌悬浮液。
　　空冷冻干燥条件是指栗包缧的方法[3]在文献中，这是稍有改善描述：将灯泡置于冰箱中在非常低的温度下，在-80℃下预冷冻12 h，然后置于真空冷冻干燥器中。冻干分离器的温度为-5℃，冷冻干燥14小时，真空度为10帕。板的在干燥的干燥步骤的温度为5℃，10小时，并在真空中干燥是3，5-帕。酸菌的上清液的制备和细胞粗提取试验菌株在4℃和4000转/分钟离心15分钟，然后将上清液并将细胞被单独收集。细胞超声处理和条件如下：PBS洗涤两次，然后再悬浮于PBS（1×10 9 CFU / mL）中，超声波断功率为23％和操作停止5秒，持续5秒，持续10分钟。

　　声后，将液体在4℃，12000rpm离心15分钟，然后除去沉淀物并过滤。膜通过0.22μm过滤器过滤以获得粗细胞提取物。定活细胞的冻干试验菌株在室温下解冻，并经受10-1的梯度稀释至10-8与液体MRS的数目，和所述应变的活细菌的数量通过测定平板计数[4]。

　　次测试需要3个相似之处。变存活率（％）=后冻干前×100测定的发酵特性的实验菌株，在3％的剂量接种在脱脂乳的中间和活细胞的数目冻干活细胞数在42℃和凝乳时间生长。乳完成后，进行酸度滴定，pH测量和粘度测量。度的测定：按GB5413.34-2010 [5]的方法，用0.10mol / L NaOH的标准溶液滴定。PH测量：在室温下与pH计平行三次，取平均值。度的测量：参考少萌[6]的文献方法进行测量。参考进行羊嘉悦[7]等人的文献中的方法的β半乳糖苷酶ONP标准曲线的映射的细胞测定的关键酶的影响。37℃水浴后10分钟1.0mL，立即加入3mL 0.5mol / L Na 2 CO 3以停止反应。入酶溶液后，向空白样品中加入Na 2 CO 3，然后加入到ONPG磷酸盐缓冲溶液中，在420nm下测量光密度值。用LDH试剂盒南京建成生物有限公司进行乳酸脱氢酶的测定，和酶活性的单位是由U.影响表达对细胞的渗透性膜王的实验方法Hao [9]及其合作者使用Fluo3-AM荧光探针检测乳酸菌细胞内Ca 2 浓度的变化。验数据处理和分析数据用M±SD表示，并使用SPSS 17.0对结果进行统计和统计分析。果和讨论之前和冷冻干燥后是一个完整的压力处理的活细菌的数目：在冻干真空过程中形成的冰晶造成机械损伤和破坏细胞的完整性，从而导致的速度降低细胞存活。当添加冷冻保护剂可以增加细胞活力，从而维持细胞活力。验中使用8％的蔗糖，60％甘油和15％脱脂乳的混合物作为用于在真空冷冻干燥冷冻保护剂，和前的活细胞的数目和冻干后在表1中呈现。表1中的是细胞在MRS以下冻干的活性相比，冷冻干燥前观察到的并在24小时冷冻干燥之后下降，发酵乳杆菌grx08，干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的grx12 LV108可行账户分别为9.28，9.37和9.64。冻干燥后，培养24小时后，三种乳酸菌菌株的活菌数也显着减少。干前后比较活细胞的改变，乳酸杆菌的存活率grx08发酵和鼠李糖乳杆菌LV108冻干后均较高，分别为93％和94％。较干酪乳杆菌grx12的存活率。低，86％。冻后三种菌株的存活率不同，这可能是由于不同种类的乳酸菌在真空下冷冻干燥的抗性差异。冷冻干燥之前和之后的发酵特性的变化在3％之前和冻干后接种到脱脂牛奶，时间，pH，酸度和样品的粘度的凝乳进行比较。果示于图1中。1中的数据的（a）表明，冷冻干燥前3个乳酸菌凝乳时间是7至9个小时，这并不是很不同的。冻干燥后，凝乳时间稍长，包括改变grax12较高，平均8.8小时冻干前可完成豆腐和冷冻干燥后，平均10.83小时。干后存活率显着降低。于图1（b）和图1（c）在图中乳酸的程度和冻干后的三种菌株乳酸菌的pH都没有从那些冷冻干燥前显著不同。冻干燥后凝乳干燥过程中酸度的变化约为1°T，pH的变化也约为1°T。常，冷冻干燥后，应变的变化，由于细胞膜和维持细胞内和细胞外的pH梯度的酶的失活的渗透性而导致的pH梯度的破坏引起pH值的变化[9]。验的三个菌株的平均细胞内pH与正常细胞的平均细胞内pH没有显着差异，这可能与添加保护剂有关。在于牛奶中的蛋白质发生变性沉淀在酸性条件下和乳酸菌的新陈代谢产生构成发酵乳[10]的粘性特性的细胞外多糖。可以在图1（d），该乳酸菌的三种菌株的粘度值在冷冻干燥后和鼠李糖乳杆菌LV108值的粘度下降是比较稳定的，其可以被连接在速率改变可以看出冻干后乳酸菌的存活。的之前和冻干后的β半乳糖苷酶β半乳糖苷酶的β半乳糖苷酶活在细胞代谢中的关键酶活力的影响在发酵过程中确定发酵速率。前和冻干后的lactosidase活性变化检测在体外和体内的乳酸细菌的β半可以被确定冻干乳酸菌的发酵活性的作用和膜的渗透性细胞。ONP标准曲线实验确定并且结果显示在图2中示出的内部和前和冷冻干燥后的乳酸菌外总酶活性的结果示于表2中的横坐标使用ONP质量（ΔG）和纵坐标OD420。制标准曲线。性方程为y = 0.201 7x-0.184，相关系数为0.999。性关系良好，符合定量要求。2表明，乳酸菌冷冻干燥后增加，而细胞内的酶的活性降低，这表明在真空下冷冻干燥增加细胞膜乳酸菌的的磁导率的三种菌株的胞外β半乳糖苷酶的活性。果，代谢酶从细胞内溢出到细胞外。变化前的菌株的和冻干后发酵特性的结果相结合，已经表明在真空下该冷冻干燥导致β半乳糖苷酶的活性降低，这可能是导致变化的因素之一三种乳酸菌的发酵特性。酸脱氢酶活性的变化乳酸脱氢酶（LDH）被认为是一种关键酶和限制糖酵解速率的酶[11]。前和之后的冷冻干燥检测乳酸菌LDH的总酶活性的变化也是在发酵和膜渗透性检查的效果冻干的细菌的活性的重要手段细胞。实验过程中，测定乳酸脱氢酶的后三个乳酸菌菌株真空冷冻干燥的可行性，如表3所示。3显示了细胞内LDH的乳酸菌的总活性冷冻干燥后，显著降低：发酵乳杆菌grx08减少了4，148ü冻干前3185 U，干酪乳杆菌grx12减少从3.82到2.815 U U和鼠李糖乳杆菌LV108被冻结。干燥前和干燥后的区别是显著，范围从7037 U给4667 U，表明乳酸脱氢被损坏到乳酸菌的冻干后不同程度。
　　改具有对乳酸菌的发酵活性的直接影响的乳酸脱氢酶的活性，由于冷冻干燥中LDH活性的降低还可以是导致的降低的原因之一菌株的发酵活性。细胞膜通透性的影响细胞膜损伤后通透性增加导致细胞外Ca2 内流和细胞内Ca2 浓度增加。用之前，以确定在乳酸菌的细胞内Ca2 的荧光强度为荧光探针Fluo3-AM的方法和冻干后（荧光强度与钙离子浓度变化，并且正比在Ca2 浓度下）。果如表4所示。4显示，在相同波长条件下，三种乳酸菌菌株的细胞内Ca 2 荧光强度不同（即浓度），但在真空冷冻干燥处理后，变化趋势是恒定的，并且荧光的强度提高乳酸的三个细菌菌株的细胞内Ca 2 。离子L.fermentum grx08，干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌LV108 grx12冻干前分别为68.29％，80.63％和冻干后84.66％的浓度，表明的是，冷库安装完整性冻干后细胞膜被破坏。生活增加了。Wang等人[9]发现，细胞内Ca2冻干是 后比正常细胞高得多，而细胞内Ca2 正常细胞的浓度表示只有22.4％的冷冻干燥的细胞的浓度;没有添加保护剂的细胞减少约40.0％。该实验中，冻干乳酸菌后钙离子的浓度没有显着增加，这可能与添加保护剂有关。论本研究在冷冻干燥株发酵乳杆菌grx08，干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌grx12的过程中存活的变化，发酵的特性，代谢关键酶和细胞膜的渗透性LV108 3.关键酶的作用，以及细胞膜通透性变化对乳酸菌发酵特性的影响。果表明，细胞存活率降低以下冻干并且当凝乳时间延长粘度的值下降，但是凝乳的酸度和pH没有太大的改变。外，在细胞代谢，β半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶的两个关键酶，进行了所有的三种菌株的lyophilisation.Le的Ca 2 之前冷冻干燥用荧光探针Fluo3-AM的方法测量后衰减。度的增加表明细胞膜的完整性被破坏，并且冻干后细胞膜的增加，其可以导致在应变的发酵性能的下降的关键因素的渗透性。
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