目的：探讨聚合酶链反应（PCR）在冷冻羊肉羊含量检测中的应用。法：细胞色素b基因被用作羊和线粒体rRNA基因12S的特定基因用作内标基因，从羊传送的含量进行定量测定由ΔCT法并与称重法。果的影响。果：当绵羊含量在1％-100％（R2 = 0.990 1）时，荧光PCR建立的标准曲线具有良好的线性关系。

　　冷冻贸易的七个样品进行了测试，通过荧光PCR和称重方法的羊含量检测的绵羊含量之间的相关系数为0.945 0（P <0.001）和平均绝对差-11.0％。（-7.4％， - 14.6％）。因拷贝数和绵羊脂肪之间的差异对内部参考基因扩增的Ct值没有统计学显着影响（p值分别为0.072和0.206，分别）。论：荧光PCR可用于快速检测冷冻绵羊皮中羊肉成分的相对定量。量聚合酶链反应荧光;定量检测;用于羔羊面包congeléGU文家定量检测羊肉的实时PCR的用于羔羊的定量检测的方法，通过在实时（PCR）荧光聚合酶链式反应的羊应用羊肉冷冻辊方法：基因线粒体细胞色素羊b（细胞色素b）作为特定于用作内源性对照的物种和线粒体rRNA的12S引物被选定经由ΔCT对实现相对定量将获得的结果与称重方法的结果进行比较，并分析可能影响定量结果的一些因素，包括基因拷贝数和羔羊脂肪含量。果：在ΔCt和羊肉含量之间显示高相关系数（R2）= 0.990 1）在1％至100％范围内。
　　时PCR结果与加权方法之间的相关性七种样品上市冷冻羊肉卷具有统计学意义（R2 = 0.945，p <0.001），平均绝对差值为±11.0％（95％置信区间为7.4％）和14.6％）。量检测期间羔羊的基因拷贝和脂肪含量没有统计学意义（分别为P = 0.072和P = 0.206）。论：实时PCR方法可作为一种快速实用的羊羔定量检测方法。冻羊肉卷。键词：实时聚合酶链反应;定量检测; lambDOI：10.15922 / j.cnki.rlyj.2016.07.006中图分类号：TS251。7文献编码：A文章编号：1001-8123（2016）07-0026-04引用格式：谷文家，许跫，章一南和绵羊辊其他检测羊内容冻结链式反应荧光聚合酶[J]。类研究，2016年，30（7）：26-29 DOI：10.15922 / j.cnki.rlyj.2016.07.006 HTTP：//rlyj.cbpt.cnki.netGU文佳，徐琼张义南及其他执法实时荧光聚合酶链反应（pcr）定量检测冷冻羊肉卷中的羊肉[J]。类研究，冷库安装2016，30（7）：26-29。（中文摘要，英文）DOI：10.15922 / j.cnki.rlyj.2016.07。Http://rlyj.cbpt.cnki.net 006在羊混有其他肉类的“混合羊肉卷”是不是在市场上只卖出了，但也有因严重安全隐患身份不明的肉。[1-2]。合的常见方法是将鸭肉或猪肉与羊肉混合，加入尾油，在羊肉排骨之间加入脂肪，在肉柱中冷冻并出售。冷冻羊卷。管污点的羊被按下并切片，脂肪酸部分和细粉是红色和白色和边界被明确定义，但真正的羊的间脂肪线是自然合理和相互渗透，这是依据识别真假羊卷。有客观和定量的标准。识别肉类掺假的方法中，最常见的方法是核酸分析，包括聚合酶链反应（PCR）[3-4]，多态性PCR限制性片段（PCR片段的长度）。态性，PCR-RFLP）[5-6]，测序方法等[7-8]。量荧光PCR灵敏，快速。被广泛用于肉类成分的鉴定，并已被国内外推广为标准方法[9-11]。目标肉产品进行测试，以含有其它物质，荧光PCR方法可提供快速定性结果[12-15]，但是，当在一定肉含量的额外定量检测在混合肉类产品，所述情况要复杂得多。

　　
　　然荧光PCR方法定量结果有很多的影响，国内外许多专家更喜欢他们，因为他们灵敏的方法rapides.La研究探讨产品的定量检测的灵敏度和准确度肉掺假[16-17]。本研究中，通过荧光PCR估计冷冻绵羊绵羊组分的荧光水平，通过与称重方法的比较验证了其准确性和可行性。分析为通过荧光PCR方法定量检测绵羊组分提供了基础。料和方法材料和试剂在实验室收集羊肉，鸭肉和猪肉的实验样品，从批发市场购买冷冻羊肉卷并称重和取样。DNA提取试剂盒（）罗氏; Exmix Ex Taq™PCR预混料（RR390）大连宝生物工程有限公司仪器设备定量PCR快速荧光美国公司ABI，研磨冷6870家美国公司SPEX样品制备biométrophotomètre6131，5415R离心机德国公司的Eppendorf，分析天平AL204（测量0.1毫克）秉性 - 托利多，瑞士。法称取50mg样品中DNA的提取，并按照试剂盒“DNA提取到组织中”的说明进行。55℃下加入，在50 mg组织，浴200升溶胞产物和20微升蛋白酶K的1个小时，在70℃下10分钟，加200升的粘合剂溶液，混合，放置，加入100微升异丙醇，混合并转移至离心柱。心，洗涤两次，用100μL稀释液重悬DNA，并在4℃下储存。物和探针引物和探针由Shanghai Handsome Biotechnology Service Co.，Ltd。成，和序列如表1所示。时PCR扩增系统和实时条件PCR系统代表20μL，其中1μLDNA模板，10μL实时PCR预混物，0.4μL Rox和0.4μL上游和下游引物（10mmol / L）。（10 mmol / L）0.6μL，补充超纯水。实时PCR仪的反应条件如下：预变性95℃30秒变性，在95℃下5秒，退火60℃35秒和40个循环。ROX染料校正荧光值。部校准系统的建立选择线粒体基因内部校准基因，线粒体12S rRNA基因，分别重6份相同的质量绵羊肉，鸭肉和猪肉。因。较获得的Ct值之间的差异。同变异体脂肪含量的比较将肌肉组织和绵羊脂肪以3：1，1：1，1：3的质量比混合，绵羊的肌肉含量为25％， 50％，75％和100％。品。据1.3.1节的方法提取DNA，使用实时PCR仪测定绵羊特异性基因和内部参考基因，并测定其差异比较四组之间的Ct。准曲线的建立鸭的羊和肌肉组织的[19]的配合比新鲜肌肉组织和产生具有100％绵羊质量，50％，20％，10％，5绵羊鸭分别为％和1％。合肉标准品，每组4组，根据1.3.1节中的方法进行DNA提取。异性基因（细胞色素b（Cytb））和内部参照基因（12S）分别为通过实时PCR确定。rRNA基因）。于获得的值Ct，根据式（1）计算。

　　
　　ΔCT= CtCytb-Ct12S rRNA基因（1）随着ΔCT纵轴绵羊的在对应于水平的标准比例的对数坐标以建立校正曲线。重市售样品的方法一旦冷冻的绵羊卷完全解冻，将所有可剥离的肉块单独标记并逐个称重。洗地表水后，从组织中心取出约50毫克，采用1.3.1节的方法。行DNA提取并使用实时PCR仪器测量绵羊特异性基因以进行定性测定。据式（2）计算绵羊卷中羔羊的质量百分比。光PCR用于市售样品被用于随机地选择冷冻羊辊的不同的部分，完全粉碎并混合，提取DNA，并通过PCR扩增，并通过PCR扩增得到的ΔCT值通过荧光在1.3.6的标准曲线中引入。给出了商业绵羊卷中羊肉质量的百分比。与称量方法的结果进行比较，以验证定量方法的准确性。部校准系统的结果和分析该实验开发了双荧光PCR反应，即在同一反应管中同时扩增靶基因和内部参照基因。于Ct的两个值之间的差异然后推断，获得起始DNA中基质浓度的差异。同动物的质量比。了校准的小区的大小和不同的动物之间的基因的线粒体的拷贝数，重量6份相同的质量羊，鸭，猪，DNA的提取respectivement.Après的，调整的浓度Ng /μL模板DNA并获得参考基因的Ct值。羊为15.72±0.35，鸭肉为15.96±0.48，猪肉为16.24±0.49，各组之间无显着差异（F = 2.969，P = 0.072）。DNA模板连续稀释10倍后，使用Ct值作为纵轴获得回归方程的斜率，将模板DNA的稀释因子作为横轴获得。闭。该实验中，在相同品质的羔羊，鸭和猪肉之间内部参考基因的表达没有差异，这可以作为随后的双荧光PCR的内部参考。羊脂肪的作用是将绵羊肌肉组织与羊腹脂肪混合到一定程度，得到4只绵羊脂肪样品，提取后分别为0％，25％，50％，75％。DNA，将模板DNA的质量浓度调整为50 ng。定/μL，绵羊特异性基因和内参照基因的Ct值，结果如表2所示。组之间无显着差异（F = 1.774，P = 0.206） ）。立标准曲线绵羊和鸭肌肉组织的新鲜肌肉组织充分混合，标准100％，50％，20％，10％，5％和1％混合绵羊/鸭羔羊的质量已经准备好了。用实时PCR仪器分别测定绵羊特异性基因（Cytb）和内部参考基因（12S rRNA）。据得到的Ct值，根据公式计算ΔCt。ΔCT取纵坐标的百分比的对数（重量）羊的标准对应于用于建立校正曲线的水平曲线和线性方程为：y = -4.501 9.458 9X 8，R？商业上可获得的冷冻绵羊卷的定量测试同时测试购买的冷冻绵羊卷，通过称重法和荧光PCR法测定绵羊含量。果列于表3中示出由荧光PCR和称重方法的羊含量检测的绵羊内容之间的相关系数为0.945 0和P <0.001表明，二者之间的相关性非常高。

　　

　　荧光PCR法检测的绵羊含量与称重法进行比较：绝对差异为-11.0％，95％置信区间为（-7.4％， - 14） ，6％）。于定量检测混合肉中各组分质量比的讨论一直是肉类检测的难点[20]。光PCR方法灵敏且快速，许多研究探索了使用它们定量检测掺假肉制品的可能性。该研究中，通过荧光PCR测定冷冻绵羊卷中绵羊组分的质量比，并且市售冷冻绵羊卷中的绵羊肉含量在10％时为8.5％。35.6％。比于称重法，我们发现，这两种方法之间的相关性是高的（R = 0.945 0，P <0.001），其可以用作肉的定量检测的在实验室的快速且简单的方法。本申请中，通过定量PCR获得的DNA拷贝数直接转化为每种肉组分的质量比受一些因素的影响[20-21]。先，不同大小的动物细胞，染色体倍数，基因组大小，拷贝数等。响定量结果[21-22]其次，未知肉的成分也影响定量结果，不同含量的DNA，甚至优质的面料下面是关键：肾脏，心脏，肝脏，肌肉，大脑，皮肤[17];再次，DNA提取和PCR扩增的效率也会影响核酸定量的准确性[23]。立包含内部参考系统的实时PCR系统可以尽可能地消除由DNA提取效率和PCR扩增效率引起的差异，从而获得定量结果更接近真实值[24-25]。这项研究中，使用含有内部参考系统的双荧光PCR系统：DNA和PCR分析用于提取相同质量的羊肉，冷库安装猪肉和鸭肉，以及比不同基因的拷贝数和绵羊的脂肪含量。果无统计学意义。此，该方法可以广泛使用，样品中的脂肪含量和混合肉成分对绵羊的定量结果几乎没有影响。量混合肉的结果在同一个实验室中，当使用相同的样品制作标准曲线和盲样时，定量结果通常非常准确[26-28]。遇到实际样品或多种混合肉制品时，荧光PCR的定量结果将与实际结果显着不同[4，29-30]。Zhou等[4]模拟了含有猪肉成分的混合肉样品，猪肉成分样品的平均回收率为122.27％。Kappel等。[29]发现定量结果与荧光PCR获得的实际值之间的误差小于±30％。光PCR法检测的绵羊含量结果低于称重法，平均差异为-11.0％，95％置信区间为（-7.4％， -14.6％），这与上述研究人员的结果非常接近。进行绵羊皮中绵羊组分的定量测定时，该方法的结果更加保守，但是需要进一步研究这种差异的可能原因。
　　对而言，使用其中的肉制品的小部件可以容易地分离称重和它们的总数量是小的，如冷冻羊肉辊和肉串，这也是一个方法高效准确的方法值得一试。
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