要通过建立快速冷冻用人类精子商业SpermCryoTM全能猴子没有蛋黄的液体猕猴精子冷冻保存的方法，（-435℃/分），平均速度（-183℃/ min）和慢速（ -69℃/分钟的冷却速度），并冷冻在冷冻保存食蟹猴精子平衡（10分钟和30分钟）的不同时期的效果。

　　果显示，冷冻后30分钟和与液氮相比平衡10分钟时，食蟹猴精子复苏活性显着增加。存在快速和中冷冻率的复苏活动精子较高，且冷冻精子的复苏活性比存储在慢速冷冻精子率较高显著。究建立并优化冷冻保存方法猕猴精子冷冻液无精子，它可以快速，轻松地完成精子冷冻保存的冷冻保存，并获得较高的成活率。研究结果对深入研究灵长类动物精子冷冻机制及其在辅助生殖中的应用具有重要意义。蟹猴精子，SpermCryoTM所有轮，冷冻冷却速度冻结时间以达到平衡CLC S857.2 1文档代码的一部分号0517-6611（2015）13-148-04Abstract为了建立一个新的使用冷冻保护介质中而不蛋黄SpermCryo轮食蟹猴的精子冷冻保存方法，在液态氮和不同的冷却速率保持最小时间（10和30分钟，分别地）的影响（ - 69，-183和-435℃/结果表明精子在液氮10分钟的冷冻保存允许一个postthaw更高的存活率超过30分钟，在快速冷却速率和平均冷冻保存（-183和-435℃/分钟）显示在一个缓慢冷冻速率（-69℃/分钟）postthaw比冷冻保存精子更高的存活率。ropreserving优化的协议PO在我们的研究中使用SpermCryo无蛋培养基的精子食蟹猴可以达到低温ra优选。Te和优化的协议是易于使用，并且可以节省时间和工作我们的研究结果将有利于研究，以了解细胞损伤的低温储藏过程中的机制和完善的技术辅助生殖话primate.Key非人类食蟹猴; SpermCryoTM全能平衡冷却时间的灵长类动物为实验动物，广泛应用于生物医学研究，由于其巨大的生理，生化和遗传相似于人类，使之成为一个合适的动物模型的研究人类疾病。而，由于人类已经破坏了灵长类动物栖息地，它们的数量急剧下降。传资源的低温保存是灵长类动物保护和保护灵长类动物生物多样性的有效手段。前，灵长类动物的精子冷冻保存方法基本上是经验性的，难以准确重复。蟹猴是一类重要的灵长类实验动物。精子冷冻保存后，它们经常因冷冻而受损。苏后，精子活力大大降低，其受精能力降低[1-3]。研究表明，不同种类的冷冻液体具有保护对食蟹猴的精子冷冻不同的效果，并冷冻保存后精子的活力复苏也有很大不同。4]其中迄今已报道的液体的灵长类动物精子冷冻，蛋黄是主组件非渗透保护剂之一，其使用浓度通常为10％是20％[5-6]。黄一般认为主要是由等离子体膜相变精子并用作关于[7]在蛋黄中发挥重要作用可以是类低密度脂蛋白的冷却休克，蛋黄卵磷脂可能仍然是稳定的精子细胞膜可以防止顶体破裂，减少因冷冻引起的热冲击[8]。而，由于蛋黄成分的复杂性，研究精子冷冻引起的损伤机制变得非常困难。外，由于黄通常由禽蛋衍生，它可以携带潜在感染性病原体（病毒，细菌，支原体）[9-10]，这大大增加了污染和甚至精子的风险他们受精的能力。低冷冻精液的体外受精和人工授精的成功率，增加疾病传播的风险。外，蛋黄的来自不同源的质量是不均匀的并且在防止霜冻精子的保护作用[11-12]，这是难以标准化的差。此，建立一个冷冻液安全，有效，质量可控无蛋黄，以及相应的冷冻和冷却过程是在辅助生殖技术和机制冷冻精液的研究至关重要精子冻结造成的损害。冷冻保存外，冷冻和冷却速度也是影响动物冷冻精子复苏成活率的重要因素之一。个物种精子冷冻保存的适当冷冻速率与所用冷冻剂的类型和冷冻保护剂浓度有关[13-15]。冷冻精子当前的研究表明食蟹不同的冷却速度[3，16]，并没有报告冷却速度猕猴。
　　SpermCryoTM全能施加到液体蛋冷冻冷冻保存人精子而不购物黄色[17]，使用甘油作为冷冻保护剂的低温液体，使用冷冻储存致冷剂简单的程序人精子，质量标准化冷冻液成功应用于人类精子的冷冻保存[17]。而，迄今为止还没有关于使用SpermCryo在灵长类动物的精子冷冻保存中的研究报告。此，我选择食蟹猴如测试对象，以恢复冷冻精液的运动性和顶体指数如检测的精子功能状态，使用的冷冻液体冷冻保存精子冷冻SpermCryo食蟹猴研究时间冷却该液体氮蒸气和冷冻食蟹猴的回收冷冻精子效率不同的冷却速度的影响，优化冷冻法，可能建立的黄色系的保护方法冷冻液体蛋SpermCryo cynomolgus猴子精液不冻结。料和方法实验动物雄性是健康和肥沃的食蟹猴的男性（年龄在8至10岁）李亚玲昆明生物科技有限公司，由国际协会AAALAC认证。个猕猴保持在一个单一的笼子，并保持在12个小时，12个小时，并在17和C之间22°的使用和实验动物的试验的方案经委员会室温昆明雅凌生物科技有限公司动物管理与利用（IACUC） SpermCryoTM Allround试剂是商用冷冻液（Provitro，Fredericia，Denmark）。萄糖，乳糖和牛血清白蛋白（BSA）获自Sigma（St.Louis，MO，USA）。冻秸秆来自IMV Technologies（IMV，L'Aigle，France）。生凝集素获自Molecular Probes（Alexa Fluor PNA 488，Molecular Probes，Eugene，OR，USA）。性的精子采集用盐酸氯胺酮肌肉注射麻醉（4毫克/千克体重）和精子通过使用制造S44方波发生器阴茎的电刺激所收集由Grass，USA [18]。定冷却速度和解冻和加温用于确定所述精子的冷却速率和除霜加热上次报告[16，19]中描述的速度的方法的速度。蟹猴中装入0.25毫升冷冻成薄片冷冻精子的，直径0.25毫米5SRTCTTT30的T型热电偶的一端（欧米茄Engieering，斯坦福德的公司，CT，USA）被引入在吸管中，USB热电偶数据采集模块8通道的另一端（TC088，欧米茄Engieering公司，斯坦福德，康涅狄格州，美国）连接。电偶数据采集模块连接到微型计算机，运行软件TC088，然后将冷冻的吸管在泡沫托盘从液氮的表面1，4和7厘米至收集的变化每秒温度，然后计算液氮的表面距离。结不同距离的冻结率。似地，冷库安装装有冷冻热电偶吸管直接放置在水浴中在37℃下从液氮2分钟-196℃，并且使用收集的数据计算热电偶数据采集模块和解冻后的恢复率。子冷冻食蟹猴并在37℃30分钟的水浴中解冻收集精液液化后，覆盖含有乳糖0.15摩尔的0.15 mol / L的稀溶液/ L葡萄糖和0.3％的BSA终浓度为7×106 / ml [20]，检测新鲜精子的运动性和顶体的完整性。冻剂SpermCryo（精子相比冷冻溶液3：1）在室温下加入，并在室温下静置10分钟，然后，精子是根据本说明书SpermCryo的方法冷冻。后，将精子置于0.25毫升冷冻吸管密封和吸管分别冷却至4厘米的液氮上面对于10和30分钟，和然后直接存储在液氮用于低温保存。精子复苏时，将吸管直接置于37℃的水浴中2分钟并搅拌以使精子复苏。子功能检测精子活力的检测。子从10微升新鲜精液样本的收集或冷冻解冻的被放置在预热的37℃下的板Makler精子计数，精子计数在光学显微镜下记录在运动，计算运动精子的精子总百分比，即精子的运动能力。次计数至少200个精子，每个样品计数两次，最后根据两个计数计算精子活力。后将冷冻保存精子率根据下列公式计算：精子的冷冻保存=精子运动的速率冷冻/精子活力价格×100％后。测顶体的完整性水平。
　　精子样品展开并放在通风橱的平台上;在室温下完全干燥;将无水乙醇滴加到涂片中，均匀且完全覆盖涂片;无水乙醇中自然干燥后，涂片放置在潮湿的腔室中，由盖所包围和盒是暗湿处理，并且放置在热和潮湿阶段盒37℃，和Alexa Fluor488PNA在涂片上将溶液降至10μg/ ml，在37℃下30分钟;将Fluor488PNA与PBS溶液一起冲洗掉涂抹表面，将涂片置于37℃相温下，并让空气干燥屏蔽;检测涂片置于荧光显微镜顶体完整性下（发射光的波长为515nm，激发光的波长为488nm）。顶体填充的精子头染成均匀的苹果绿色，而顶体顶体头部仅部分染色或不染色。意完整精子在精子总数中的百分比。次记录至少200个精子。数200个精子并计算顶体的完整性[21]。室温下在根据本说明书SpermCryo.Le精子报告/冷冻的溶液中加入的平衡时间上复苏和食蟹猴精液液化的活力和所收集的精子冷冻SpermCryo溶液的稀释后的效果为3：1，环境温度为10分钟。精液置于吸管密封中后，将吸管置于液氮上方4cm处10和30分钟。液液化食品冷冻保护剂猴冷却在室温下收集精液的速率食蟹活力的效果，冷冻精液SpermCryo并将冻结液体3：在室温下10分钟1，静止。精子倒入密封后，将吸管冷却至液氮上方1，4和7厘米处，冷冻平衡时间更好。计和数据分析所有数据均表示为平均值±SE（x±SE）。子活力百分比和顶体完整性百分比在t检验数据之间显着不同，P <0.05表示显着差异。子活力和顶体完整的百分比已被逆正弦变换校正，并且单向ANOVA用于测试来自ANOVA的数据之间的差异的显着性方式。P <0.05表明差异显着。果和时间的讨论对猴子精子食蟹恢复活力制冷冷冻平衡精子从正面410和30分钟冷冻的氮平衡食蟹厘米，活力恢复冷冻保存后，测定精子。图1所示，相对于新鲜精子，冷冻保存显着降低了精子活力（P <0.05）。冻结了液氮存储有冷冻保存10分钟的时间在10个30精子复苏min.L'activité精子之间的差异显著比冷冻保存的显著更高30分钟（p <0.05）。图2所示，相对于新鲜精子，冷冻保存显着降低了精子的完整性（p <0.05）。而，在液氮上方的冷冻平衡中精子与10分钟和30分钟之间没有观察到显着差异（P> 0.05）。1.4后的冷却冷冻精子的精子食蟹猴在从表面液氮食蟹猴的活力的回收率的影响和7厘米冷冻冷却速度在液氮中分别在-435℃，-183和-69℃/ min冷冻10分钟。精子从液氮转移至-196℃，在37℃的水浴中，并以1200℃/ min的速率解冻（表1）。表1所示，相对于新鲜精子，冷冻保存显着降低了精子活力（p <0.05）。储在快速冷冻（1厘米以上液氮表面），并在中速（液氮表面积高于4厘米）的复苏活动精子比缓慢冷冻显著更大（液氮表面上方10cm）（P <0.05）。冻保存的精子大于1 cm和4 cm大于液氮的复苏活性无显着差异（P> 0.05）。图3所示，冷冻保存显著降低精子的顶体的完整性相对于新鲜精液（P <0.05），但精子顶体的完整性不不同冷却速度组间差异有统计学意义（P> 0.05）。论SpermCryo冷冻流体已被成功地应用到精子humain.Le冷冻推荐的液态氮蒸气的平衡时间的冷冻保存是30分钟[17]。究表明，液氮蒸气的平衡冷冻时间会影响恒河猴精子的复苏活力[16]。而，平衡时间对冷冻保存和食蟹猴的复苏过程中冷冻保存食蟹猴的影响目前尚不清楚。究表明，随着膀胱内冰核开始形成，细胞外渗透压增加10倍[22]。此，冷冻和冷却过程中食蟹猴精液的冷冻平衡时间可能会影响细胞内冰晶的形成，导致精子损伤。者比较了不同的冷冻平衡时间上振兴精子食蟹猴通过在液体氮蒸气冷冻食蟹精子10〜30分钟的影响。
　　果表明，使用SpermCryo作为冷冻液体时，液体氮蒸气的平衡时间为10分钟和松鼠猴精子的复苏活性冻存较高。究表明，非人灵长类动物精子膜在低于冰点时的透水性低于100％[23]。此，在冷冻过程中的食蟹猴精子冷冻延长凝胶时间平衡（30分钟）之前，主要发生在脱水过程，并且可以不再是精子细胞的脱水，但可以溶质和高渗透压生理异常环境的精子浓度的长周期导致振兴精子在食蟹猴冻结活性的降低。衡制冷和Li等[1]研究的持续时间在时间​​报告冷冻平衡液氮（10分钟）类似于冷冻食蟹精子描述中的蒸汽液氮和储存的冷冻平衡蒸汽10分钟充分脱水。究表明，不同类型的细胞和不同的冷冻剂具有最佳的冷冻速率，其价值各不相同。祖尔和最佳用于细胞冷冻冷冻冷却速率过程中存在时，该项目“两个因素”凝胶细胞假设损坏[24]细胞内如果冰的冷却速率过快，精子不充分脱水，水分已经在细胞内形成。此，精液通过细胞内冰的形成损坏，如果冷冻速率太慢，从而导致过度的溶质浓度和细胞外液的渗透压，所述细胞在这种异常的生理环境中长时间保留并被溶液破坏（溶液损伤）。此，当在冷冻过程中以最佳冷冻速率使用精子时，获得最高的精子冷冻复苏活动。前的研究已经表明，冷却速度差异可影响冷冻食蟹猴冷冻保存精子在适当的液态氮为4厘米，速度的表面侧的冷却速度的冷冻 - 解冻的精液的可行性冷却-183℃/ min [16]。而，在SpermCryo的商业说明中不推荐精子冷冻保存的最佳冷却速率。个不同的冷却速率，4和7厘米的研究（对应于冷却速率-435，-183和-69℃/分钟）冷冻精液食蟹猴，不同的冷却速率是在食蟹猴相比精子复壮的影响。果表明，虽然使用-435℃/ min的冷冻速率，但获得了最高的精子再生活性。而，在-183℃/ min的冷冻速率下获得的精子回收率没有显着差异。与冷冻保存恒河猴精子的最佳冷冻速率183°C / min不同[16]。可能是由于物种之间的差异或使用不同的冷冻溶液和冷冻方法。外，精子冷冻速率的冷冻保存和冷冻平衡时间后影响至少顶体完整率，精子活动力，这表明蠕动到冷冻的速率和更敏感平衡时间。类似于解冻后精子顶体完整率，复苏精子猕猴保持与含有蛋黄，李等人报道了冷冻液。[1]。究表明，不同类型的冷冻保护剂在精子复苏过程中精子冷冻保存活性存在显着差异[4]。于冷冻液的无黄很简单相比，冷冻液体组成，其研究冻存猕猴精子的保护机制是非常重要的。外，蛋黄中可能含有的感染性病原体（病毒，细菌）会增加健康和安全风险[9-10]。过使用非SpermCryo冷冻精子冷冻保存黄色液体水平猕猴获救41.9％的回收率冷冻精子到达帕拉斯大号SpermCryo使用的冷冻精子冻存液实现回收率报道人类精子（32.3％）。外，冷冻保存单SpermCryo，快速冷冻液体时，完整的测试精子冷冻过程的优化后只需要20分钟，冷冻过程的表观精子，上面的时间（180分钟）短的[25] ，程序很简单。者所用的冷冻SpermCryo液体冷冻保存从食蟹猴的精子和研究液氮蒸气平衡时间的效果和对冷冻保存精子的活力复苏的冷却速度并开发了一种冷冻保存精子的方法。了在液氮中冷冻蒸气食蟹10分钟猴精子平衡和1液氮冷却速率和猴精液冷冻保存恢复食蟹高活力4厘米可用性的表面。使用SpermCryo没有广告这个冷冻蛋黄液可以轻松，快速地完成猴子的精子冷冻保存冷冻食蟹猴的传统方法，用猕猴精子的冷冻损伤机理和应用综合研究AHR重要意义参考文献[1]六稀释剂在猕猴精子冷冻保存细胞（食蟹猴）和恒河猴（猕猴）李Y，K蔡，李J和al.Comparative研究[ J] J Am Primatol，2006，68（1）:. 39-49。2] FERADIS AH，PAWITRI d，SUATHA IK和al.Cryopreservation附睾精子通过从食蟹猴针活检（食蟹猴）[J]收集.med Primatol，2001.30 ：100-106。3]三凯T，K寺尾，柳町R，和从食蟹猴al.Cryopreservation精子（食蟹猴）[J] .Reprod体外受精，1994，101：273-278。4] LI YH CAI KJ，科瓦奇A，和各种稀释剂和冷冻保护剂浸渍在食蟹猴（食蟹猴）的精子的冷冻保存的其他效果[J]。

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