分离并筛选在中国的高寒地区高致病性昆虫病原线虫异小嗜菌（HBN）用作研究对象并在冷冻条件及其存储条件进行了优化。果表明，在中不同含水量对线虫HBN冻结的成活率显著的影响：在50％的含水量线虫的最高回收率为87.4 ％;解冻后一小时冷冻和休眠线虫后适合于复苏，线性线虫生存率大于31.6％，直接冷却到-4℃，而水存储介质中的无菌水龙头更适合在-4℃下存活。
　　7天内冷冻的存储改善了HBN线虫对港口昆虫的侵入能力。虫病原线虫;冷冻储存;生存率;入侵CLC编号：S 476.15文献编号：昆虫病原线虫（EPN）是指存在于体内的致病性共生细菌，可引起该病。类寄生线虫是昆虫的重要天敌，对200多种昆虫具有致病作用[1]，具有广泛的适用性。而，线虫在室温下的保质期短，这是其推广和应用的主要障碍之一。
　　虫在低温下处于静态休眠状态，其代谢速率减慢，能量消耗减少，从而延长其寿命。此，今天的专家对低温存储特别感兴趣，但适用于低温存储的材料和存储技术尚未解决。春杰等[2]，根据黑龙江省冬虫自然环境条件调查结果，初步选择室内低温贮藏条件，但方式提高冻结后线虫的存活率还有待研究。储介质的类型和水分，解冻方法，冷却速率和培养基中的溶液都影响冷冻储存后线虫的存活和线虫感染宿主的能力。同的线虫中表现出的冷却速度显著差异：斯氏线虫显著增加存活率低温直接冷却后而异小嗜菌逐渐冷却并驯化。后，与直接冷却速率相比，低温存活率显着增加[3]。Grewal等[4]表明，逐步冷却使S. carpocapsae和S. riobrave的耐冷性优于直接冷却。当的渗透压可以减缓线虫的脱水并促进线虫的储存[56]。愤Yang等人[7]确认感应在低温下将培养高于0℃线虫低温的特点，但恢复到25℃后此特性具有不同程度的损失两个感染周期。多研究人员以各种方式提高抗寒性线虫在0℃以上，包括分析高度隔离致病线虫和在中国的高寒地区，它有很强的生态适应性，寒冷地区筛选。据线虫黑龙江和其低温储存潜力[2，8]，冷和内部存储的耐温性，介质类型和浓度越冬的自然现象线虫存储最初探索[911]对于线虫存储的最佳条件进行了优化，提高生存率冷冻后，探索冷冻保存的潜力，并提供一个改善储存线虫的技术的基础，从而加速了中国寒冷地区高致病性线虫的开发和应用。料和方法材料测试线虫的加拿大馆确定的哈尔滨市，黑龙江省，哈尔滨市作为嗜菌HBN（HBN）菌株的松树下的隔离高致病性病原虫土壤线虫。）]。验寄主昆虫是Galleria mellonella幼虫，购自天津中宇进出口公司。试设备和器具DHP9162的恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司），温度控制冰箱BCD226 STV（青岛海尔有限公司），解剖镜冷光S633069的源（McAudi工业集团有限公司），高压LDZX40 sCI灭菌器（上海申安医疗器械厂），200毫升玻璃瓶，60毫米直径塑料培养皿，培养箱直径90毫米的玻璃和12孔细胞培养板。验方法贮藏培养基对线虫存活和恢复的影响选自蛭石，海绵，沙子（沙子与土壤的比例为1：1）和珍珠岩。实验中使用的昆虫病原线虫HBN进行WhiteTrap [1213]，而新传播的线虫储存在7℃至10℃称取10 g各自培养基中并把它在选择方法一个200毫升的玻璃瓶根据目前不同储存介质的含水量筛选结果[8]，每种介质有4种不同的含水量（介质与水的质量比）。），蛭石的水含量是40％，50％，60％，70％，海绵的水含量为20％，30％，40％，50％和的水分含量砂含量为8％，10％，12％，14％。珠岩水的体积为80％，90％，100％，110％，总共16个处理，每个处理包括6个瓶子，每个瓶子添加来自HBN感染期的105个线虫。所有处理直接在-4℃下储存5天，然后在室温下收集玻璃1小时以收集培养基中的线虫。培养基由蛭石，珍珠岩海绵，并用80项目和500项目过滤，和500目的线虫悬浮液通过蔗糖梯度[14]和线虫离心在沙进行处理。过蔗糖梯度离心直接收集线虫。每种培养基中选择具有最高线虫存活率的水含量，并且线虫在初始存储介质中以线虫的量恢复的比例，即回收率，已经计算好了。解剖学显微镜下收集线虫的存活率。冻方法对线虫的存活的影响的溶液中加入105口线虫感染HBN至10g蛭石具有50％，共18瓶的水含量。-4°C下直接冷冻5天，然后通过不同方法解冻。（1）在室温下解冻24小时：将冷冻样品在室温下直接冷冻24小时; （2）直接用水解冻：在室温下立即加水解冻; （3）在4℃下解冻24小时：将冷冻的样品在冰箱中在4℃下解冻24小时，然后在室温下解冻1小时。
　　集解冻线虫样本之后，线虫的存活用显微镜记录并根据各种方法计算冷冻后线虫的存活率：6瓶根据各种方法由一个处理一次和解冻。冷却方法对培养基中线虫的冷冻和存活的影响称为10g蛭石，沙（1：1），海绵和珍珠岩，平均线虫浓度为104条/克。四个方面线虫的存活率最高的含水量为12％，50％，30％和100％。瓶12瓶，共48瓶，平均分为两组，一组冷却方法是直接冷却的方法，即直接在-4°C下储存5天另一组分阶段冷却，冷却至1℃/ 10分钟。
　　-1℃下储存1小时，然后在-4℃下冷却至1℃/ 10分钟，持续5天[1011]。后，将温度升至4℃并保持24小时，并在室温下静置1小时后研究存活率。在上在培养基中的介质中的溶液是由五个不同的解决方案的线虫的存活的培养基溶液效果：无菌蒸馏水（SDW），水未灭菌抽头（ATW），无菌自来水（SATW） 0.1 mol / L NaCl和M9缓冲液。储的方法，冷库安装在4℃下进行24天，然后在室温下搅拌，然后在室温下放置1小时进行1 heure.La线虫的存活用显微镜记录并在冷冻后线虫的存活率已计算出不同的解决方案。M9缓冲液：磷酸氢二钠6克，KH 2 PO 43克，氯化钠5克，硫酸镁0.128克，1升DDW，湿热灭菌在121℃下20分钟。结对线虫的侵入寄主幼虫最后蜡状幼虫的能力的效果放置在细胞培养12孔板，每孔一个幼虫和在井湿滤纸的两个层。集活线虫后冷冻和幼虫幼虫3，5和7天5接种：1，和线虫未处理冷冻HBN用作对照并且进行5种治疗在总，和3个板每人都接受治疗。种后，在25℃恒温培养箱中从细胞培养板中取出死螨幼虫并用水冲洗。25℃的培养箱中放置48小时后，幼虫幼虫幼虫进行解剖和女性中的幼虫幼虫显微镜观察数dissection.Les雌性线虫从开发感染者侵入幼虫的幼虫。此，可以计算线虫的侵入率。入率（％）=雌成螨侵入用来感染×100个统计和数据分析所有实验重复三次，每次重大螨线虫大/数数：调查的原始数据已经使用Excel和SPSS 11.5进行了分析。计算的百分比转换为反正弦的平方根，然后使用0.05单方差分析（ANOVA OneWay）和LSD多重比较测试。疗之间的差异很大。果和分析了贮藏培养基对线虫存活和恢复的影响。均含水量对线虫成活率的影响。同贮藏培养基中线虫的存活率不同。珠岩的最高存活率显着降低。他三种媒体的存活率最高。有水的不同培养基对低温贮藏后HBN线虫的存活率也有显着影响。虫的存活与在47.6％的50％较高的水含量的陨石，和线虫的存活率为70％的水含量是在陨石最低（图1a）;在具有30％比率最高的水含量的海绵线虫生存率为41.5％，线虫的存活率最低时的水分含量为50％， 15.6％（图1b），土壤中线虫成活率最高，含水量为12％，50.3％，线虫存活率最低。水量为14％。20.9％（图1c），珍珠岩100％含水量的线虫成活率最高，为34.3％，线虫成活率为当含水量为80％时降低（图1d）。高的存活率和在四个媒体率最低的线虫的存活之间的差异是显著（P <0.05），并且在较高的水含量线虫存活率是最其他三种媒体除了珍珠岩外。存培养基对线虫回收率的影响选择四种培养基的最高回收率，计算培养基中HBN线虫的回收率。果表明（图2），在蛭石的50％的病例线虫的最高回收率。87.4％，随后用砂的12％，75％，100％珍珠岩58.3％的水含量和30％的海绵14的水含量的水含量，7％。有高回收率才有利于线虫的有效应用，即从培养基中释放线虫在施用时非常有效。于存活率，并在50％的蛭石的线虫恢复是​​最高的，蛭石具有50％的水含量最适合于在-4储存冷冻℃下HBN。可能是由于不同介质的不同结构，因为线虫对外界的阻力不同，导致线虫的自由速度不同。冻方法对线虫的线虫的50％蛭石的水含量在-4直接冷冻℃保持5天，然后通过各种方法解冻的存活。中，线虫存活率在4℃解冻24小时后最高，然后达到59.8％（图3）。
　　室温解冻24小时后，线虫的存活率为第二，为45.5％。低的是37.4％。验表明，冷库安装线虫需要一些解冻冷冻条件重拾活动后，但不同的解冻条件有复苏后线虫生存的影响。以看出的是，三种类型的除霜方法中，在4℃下24小时，解冻方法是用于线虫HBN的冷冻生存有益和线虫直接解冻的存活率直接向环境温度相对较弱。不同背景上的线虫的存活最佳含水量的中间效果线虫的存活冷却方法的效果线虫两组在-4冷冻℃进行5天，并在四个HBN线虫背景已经恢复。果显示（图4），不同存储介质对HBN冷冻保存的影响是显着的。度降低的时间，然后保存在4℃后，在50％的水含量的HBN存活率最高，79.2％，和HBN存活率含水量为30％的海绵为77.2％，含水量为12.砂的百分比为70.1％，珍珠岩的含水率为100％为35.6％ 。蛭石线虫和海绵的活性更活跃在沙和珍珠岩复苏后，也许是因为存储在沙和珍珠岩线虫缺氧窒息，特别是珍珠岩中线虫的活性。常差。以看出，含水量为50％的海绵和含水量为30％的海绵适合于冷冻储存HBN。却速度对线虫冻结存活率的影响冷却速率对于在-4℃下储存5天的HBN线虫的存活率具有显着影响（图4）。珍珠岩100％含水量外，采用逐步冷却法的三种贮存介质中线虫的存活率显着高于直接冷却法（P <0.05）。50％的水含量的HBN存活率是由比直接冷却的31.6％以上，而直接冷却的在海绵的存活率含30％水的高含水量为12％的沙子为35.7分。

　　接冷却成活率高出19.8个百分点，含水量为100％珍珠岩的直接水冷却HBN成活率仅高1.3个百分点。以看出的是缓慢和逐渐冷却的方法是在蛭石具有50％的水含量，30％的海绵和12％沙子用于脱水和休眠HBN线虫有益并改善生存霜冻。中位生存期冷冻线虫线虫HBN生存率消毒自来水的50％溶液效果最高，79.2％，比水高显著未灭菌的抽头（图5），但与M9缓冲液，0.1摩尔/ L。无菌蒸馏水的NaCl之间的差异不显著。线虫的分布，长蠕孢线虫分布在加拿大，丹麦，爱尔兰和俄罗斯[1]，我们可以看到，线虫可以容忍低于0℃的长期生存率较低的温度该地区。中国，一种秀丽隐杆线虫分离在广东，山东，河北等[1516]，虽然笔者已经分离出的长蠕线虫黑龙江省[2]，但使用它的阻力冷得值得讨论。究表明，寒冷地区昆虫病原线虫HBN的最佳贮藏培养基为50％水，含水量为50％，有利于线虫的存活和应用，冷却后将相冷却至4℃。冻在室温下进行24小时。养基中含有的溶液是在冷冻过程中自来水消毒的。些条件是更适合的脱水和解冻在低温下线虫，这是更有利于生存冷冻线虫HBN和冷冻至-4℃线虫侵染的活性寄主昆虫在贮藏后7天内加强。研究结果为寒冷地区昆虫病原线虫低温贮藏的实施提供了可靠依据，为该线虫的发育和未来害虫防治奠定了良好的基础。丽隐杆线虫的脱水能力在其低温保存过程中起着重要作用，低水分休眠状态非常有利于无脊椎动物的低温保存[17]。湿度休眠有助于长期存放线虫，这改善了斯氏carpocapsae的存活率延长其为3个月的寿命和提高了其适应恶劣环境[3]。存介质和培养基的含水量对线虫的脱水率有很大影响。
　　于培养基中的水含量很重要，因此在冻结线虫的过程中它不会促进身体脱水直至休眠。虫中的高含水量导致线虫快速冻结和细胞体积破裂，最终导致线虫死亡。于介质结构不同，其储水能力和含氧量不同，影响线虫的存活。几种方法，以提高致病线虫的存活：线虫S. carpocapsae“全部”的耐寒性可以通过使用与甘油的混合物的离子溶液，可提高[5]。Chen和Glazer [18]通过逐渐增加溶液的渗透压来提高线虫的存活率。本研究中，HBN在0.1 mol / L NaCl中在-4°C下5天的存活率略高于人工自来水，但略低于无菌人造水龙头。M9缓冲液中的离子浓度和0.1 mol / L NaCl的浓度可能过高，导致线虫过于脱水，过于干燥，灭菌蒸馏水中的离子浓度为太弱，不利于线虫的冻干，使线虫在体内冻结。桃致死。Wharton等[19]估计低温线虫的存活率与降温速率有关。快速结冰的环境中，某些线虫机械由冰晶的生长，其输出所述主体皮层伤口，而较慢的冷却速度可以抑制结冰相关的免疫和有助于存活损坏线虫在低温下。时，缓慢冷却导致线虫产生保护性脱水和低水分休眠。验的分阶段冷却有利于低水分含量的休眠线虫的脱水，这也证实了先前研究人员的观点。似地，解冻速率也影响冷冻线虫的存活率。线虫在经历低温后进入休眠状态时，它在低温过程中从身体中除去多余的水，以防止结冰造成的损害。速，线虫吸收水分，细胞迅速生长，破坏细胞膜的弹性，最后细胞膜破裂。虫死了，存活率下降了。慢升温有利于细胞恢复。

　　力[20]和高渗性脱水[21]的蒸发，S. carpocapsae的传染期是脱水和安然入睡，但脱水杀线虫复苏的一个小时后未损坏。响。朗等人。[22]报道，在S. riobravis，S。arpocapsae和S. glaseri的三次低温处理后，线虫的感染性没有显着变化。常情况下，线虫，无论接种量，由于线虫之间的竞争中，只有一些人表现出较高的传染性，而其他线虫是无效的。该实验期间，线虫在低于0℃的低温储存期间消耗物理能量。冻后，线虫处于饥饿和口渴的状态，并且侵入的欲望饲养宿主更加强烈，因此短期冷藏可增加HBN线虫感染的活性。这项研究中，我们使用耐寒的昆虫病原线虫来更好地筛选凝胶中的储存条件，并获得合适的储存介质，介质中的溶液和冷却方法。而，昆虫病原线虫的耐寒机制尚不清楚。如，一系列由线虫产生的生理和生化反应的应力在低温下，包括脱水胁迫，代谢酶活性的修饰，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的转化率，累积海藻糖和新同工酶的合成[23]。温胁迫下，它也涉及一系列相关的基因，其最终反映在线虫environnemental.Il应力的耐受性的激活和去激活是基于调节的复杂系统一个需要逐步探索的网络。
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