解冻后，通过显微镜，扫描电子显微镜和吖啶橙染色观察DNA的形态，超微结构和完整性。过冷冻保存检查DNA的完整性和猪精液DNA的形态结构。效果还在于探索海藻糖和乳糖对冷冻精子的保护作用。果显示冷冻后正常精子形态发生率（海藻糖组和乳糖组分别为74.7％，67.6％）和DNA的完整性水平（66.4％）海藻糖组和乳糖组分别为63.2％和新鲜精液（95.5％和94.7％），冷冻组间差异显着（P <0.05） 0.05）;凝胶对精子结构造成不同程度的损伤，主要是由于精子头部和颈部部分或完全破裂，颈部肿胀，顶体结构破坏。冻保存; DNA;猪的形态学中图分类号：S828.3 4文献标识码：A项目编号：1002-1302（2014）01-0151-02收稿日期：2013-05-20项目基金：Science Fund江苏省自然资源（No.BK）;江苏省“蓝色工程”[编号：苏老师2010（27）];江苏省无锡市农业生产与研究领域合作项目。者简介：杨建平（1965-），男，江苏泰兴，硕士，副教授，主要从事动物医学教学和科研工作。子邮件：jstzyip@yahoo.com.cn。
子的长期保存在育种，保存低温生物遗传资源和动物遗传研究等方面具有重要意义。是，低温保存的猪肉精液的比例用于人工授精小于1％，冻融后活性仍然很差。在许多问题，例如设计率低和范围小[1-2]。多研究人员致力于研究猪的冷冻精液，但精子冷冻后缺乏DNA损伤和超微结构研究。此，本实验探讨了低温保存对猪精液DNA DNA和超微结构的影响。料和方法国家级江曲海畜牧场提供的只收集成人，健康人和性欲的精子。工收集精液并立即放入保温瓶中，并在一小时内返回实验室。精子通过特殊滤纸过滤到预热至37℃的烧杯中，然后用1：1.5和稀释剂（Minito MII稀释剂，德国）稀释。量稀释剂的构型和冷冻储备溶液的冷冻液体构型。1.1g葡萄糖，2.42g Tris，1.48g柠檬酸钠，0.06g青霉素和0.1g链霉素溶于双蒸水中并制成100ml。冻溶液配置冷冻溶液I：海藻糖组（冷冻组1），加入375 mmol / L海藻糖，0.1％十二烷基硫酸钠（SDS），0.05％维生素C和20稀释剂以％黄，乳糖组（冷冻组2），375mmol / L乳糖，0.1％十二烷基硫酸钠（SDS），0.05％维生素C稀释液加入稀释液中。20％的蛋黄。冻溶液II：将甘油加入到冷冻溶液I中，终浓度为3％。啶染色液橙色吖啶溶液橙色：吖啶0.1克溶于100毫升蒸馏水中;柠檬酸溶液：1.91g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中;磷酸氢二钠溶液：Na 2 HPO 4。12H2O 10.74g，100ml蒸馏水。用时，使用10ml橙色吖啶染色溶液，40ml柠檬酸溶液和7.5ml磷酸氢二钠溶液作为吖啶橙染色溶液。子冷冻 - 解冻方法将1：1.5稀释的精子置于17℃过夜，在17℃下离心（800g，12min），弃去上清液，冷库安装然后冷冻，加入在4°C下平衡1.5小时;冷冻溶液II预冷至4°C，精子的最终稀释比为1：2，然后平衡至4°C，分布在0.25 ml细管中，不超过45分钟，熏蒸离液氮表面10厘米处10分钟，然后将其在液氮中储存7天。冻后，将秸秆从液氮中快速取出，直接放入37℃水浴中并快速搅拌。解冻的精子收集在10ml试管中，用9体积的PBS洗涤精子。
第1组冷冻 - 解冻的精子样品在2.5％戊二醛中于4℃固定6小时，然后用PBS洗涤三次30分钟，然后掺入4％琼脂中。后在1％柠檬酸（OsO4）中固定1.5小时，然后用PBS [4]洗涤三次，之后将乙醇逐步脱水，乙酸异戊酯为将临界点干燥器干燥，喷射出喷射器的IB-5离子用金喷涂并用扫描电子显微镜（SEM）扫描。过SPSS软件分析从数据处理获得的实验数据，用于差异显着性分析。果1冷冻对猪精液超微结构的影响在扫描电子显微镜下，新鲜猪肉精子的头部，颈部和尾部（图1-A，B）完整，头部为由核和顶体组成，顶体结构完整，边界网和锐边，没有局部凸起，表面没有空隙，尾部完整。融后，猪精子的头部和颈部完全或部分破裂（图1-C，D，E），颈部肿胀（图1-E）和顶体结构被损坏（图1-E）或消失。见核结构（图1-F）。
冻对猪精液正常形态和DNA完整性的影响如表1所示。冻组1，冷冻组之间的精子形态和DNA完整性之间存在显着差异。2，对照组新鲜（p <0.05）并冷冻。冻组1和组2精子的正常形态和DNA完整性水平显着低于新鲜精子（p <0.05）。冻组DNA的正常形态和完整性水平显着高于冷冻组（P <0.05）。1冷冻对猪精液正常形态和DNA完整性的影响1正常形态学率1 DNA完整性水平195.5±1.55194.7±1.70a注：不同的小写字母后同一列表示0.05的显着差异。子受精能力的讨论与精子的形态结构密切相关[5]。
体位于精子头部的前部，含有与受精有关的各种酶。精子 - 卵子融合和顶体酶可能发挥作用之前，精子必须经历顶体反应[6]。以看出，完整的顶体结构是正常顶体反应的基础。于精子是遗传物质的主要传递者，其DNA的完整性与精子质量及其后代的生长发育直接相关[7]。研究表明，冷冻后猪精子DNA的形态和完整性明显低于新鲜精子。
扫描电子显微镜中，头部和颈部的冷冻精子的交界处被破坏，颈部肿胀并且顶体的结构被破坏或消失。多研究表明，通过冷冻哺乳动物的精子很难避免霜冻损害。伤主要与细胞内外冰晶形成引起的机械损伤和渗透压变化引起的化学损伤有关[8-9]，细胞膜[10]和Na -K -ATPase疾病[11]。研究还显示，形态完整和精子DNA冷冻海藻糖组的完整性比的组加入乳糖更高，表明海藻糖对冷冻保存良好的保护作用猪精子，与张树山等人的研究结果有关。12]一致。藻糖是一种高度稳定的非还原性二糖，可以在细胞膜外产生玻璃质保护层，在高渗透性下提高细胞耐受性，冷库安装并具有稳定的细胞膜和蛋白质结构。点[13]。
冷冻过程中，精子核蛋白对DNA双链的保护作用减弱，导致线粒体DNA和核精子基因组的损伤。链DNA变性为单链DNA，这可能是胚胎发育不良和流产的主要原因。刚琴等研究结果表明，精子DNA很可能受到活性氧的攻击，引起氧化损伤，从而导致不孕症的形态变化[7]。]。而，已经表明，人类精子冷冻保存不影响核DNA链完整精子，并且可在冷冻前加剧受损的精子的DNA链损伤的程度[14- 15]，这可能与人类精子冷冻保存方法的成熟有关。而，这也表明低温保存猪精子的方法还有待探索。
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