驴由于服务功能减弱和繁殖效率低，近年来库存数量急剧下降，但由于女性季节性发情等生理状况的影响，生殖系统和长生殖周期，精子冷冻的研究和应用尚未系统地进行。结了精子采集，稀释剂优化，冷冻后精子质量评估和人工授精的技术应用。子;精子凝胶;稀释; AI中图分类号S85822文档标识代码文章编号1007-7731（2013）03-121-04Application冷冻精子DonkeyZhang Ruitao1，2和al.Abstract的相关技术：客厅的近年来，由于拉动功能降低，缺乏生殖益处，驴的数量迅速减少。Jenny生殖器，生殖周期长，受其他生理条件限制根据国内外研究数据，本综述重点介绍精子采集，稀释剂优化，技术的应用精子质量评估和人工授精（AI）关键词：驴;冷冻精液;稀释剂;人工授精（AI）一直用于服务，辅以肉类，皮革和药品的完整使用。年来，由于农业和运输的快速发展，许多国家的蟑螂逐渐退出服务和运输行列，导致其规模缩小，库存量下降。年3.6％。

　　据“中国农村统计年鉴”公布的数据，我国面临着遗传物资资源日益恶化，蟑螂自由落体数量逐渐下降，质量逐步下降的严峻形势。
　　Lazzaro Spallanzani等人进行人工授精试验成功以来。[1] 1798年，人工授精技术通过许多研究人员的努力逐步完善，并迅速从实验转向实际：它已成为提高育种和生产力的重要手段。外，精子冷冻和人工授精广泛用于马和绵羊等动物，但它们在痰中的应用非常有限。此，冷库安装加强苜蓿人工繁殖技术研究，提高未来苜蓿的遗传质量，增加种群数量，避免品种灭绝，具有十分重要的意义。蓿。工精子授精包括四个阶段：精子采集，精子质量评估，精子处理，冷冻保存和授精。者关注精子采集的最新研究成果。内外人工授精。子采集和精子采集是人工授精的重要组成部分。国外，马和蟑螂精液的自动收集用于在射精的不同阶段收集不同密度的精子[2]，并进行精子质量评估。内精子精液的收集通常与假阴道刺激一起收集。

　　牛相比，雄性和马匹的睾丸和阴茎较大，因此痰液提取需要特殊的假阴道，其长度和内径比牛用的大得多。且雄性蟑螂进行勃起和射精的性准备活动。续时间较长，约5至30分钟，射精的总持续时间约为6至12秒，射精约为10至110毫升。液的收集之前，假阴道安装，填充有1.5〜2升的水（大约假阴道体积的一半）[3]，水温度为45至55℃ （冬季精子水缓慢冷却，夏季温度缓慢）。据环境温度和操作期间的反应适当调节水的温度。4至6层纱布放在杯口上，并将杯子连接到假阴道收集精液的末端。装假阴道后，将其置于45°C培养箱中以保持热量。

　　雄性驴爬上固定的骨骼或发情，并鼓励公众训练他的阴茎。旦阴茎勃起，精子收集器根据阴茎和公共唾液的大小调整假阴道压力。位置自然将阴茎引入假阴道[3]。射精完成时，男性蝎子的根部收缩，射精完成时射精没有收缩。假阴道竖立以将精子完全过滤到杯子中。2至3天收集一次精子[4]。化冷冻保存液精子冷冻过程中有两种主要的精子损伤类型：氧化损伤和物理损伤[5]。此，大多数关于精子冷冻保存技术的研究都集中在减少氧化和物理损伤上。
　　少氧化损伤氧化损伤主要由氧化应激引起，是影响受孕率的主要因素[6]。化应激可导致精子受损，畸形甚至男性不育[6]。浓度的活性氧可导致精子核酸磷酸化不足，脂质过氧化，运动减少和活力降低[6]，但活性物质浓度低氧气或一些控制活性氧的浓度，导致正常的精子生理功能（如精子获能，顶体反应和受精信号）发挥重要作用[ 7]。精子被冷冻时，在精子储存稀释剂中加入适量的抗氧化剂或抗氧化酶可能不会降低精子质量[6]。生素E可以直接阻断亚铁抗坏血酸脂质过氧化产生的自由基，如过氧化氢和烷氧基，因此被用作主要的抗氧化剂[8]。Mn2 可通过减少氧化应激来增加精子活力，存活时间，精子获能和顶体反应[9-10]。研究发现，在冷冻稀释剂中添加维生素E和Mn2 可以保护精子免受牛，绵羊和山羊[7]，猪，狗和人类的侵害，并提高精子的质量。子的运动，如精子的运动和解冻后膜的完整性。
　　标。氧化酶也是一种天然抗氧化剂，主要包含超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶，谷胱甘肽酶（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GR），其消除过度活性。气可保护细胞结构免受损坏。斯塔曼特Filho等[11]相比精子马脱脂乳黄色稀释和过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶和在冻融精子的总的稀释精液。变了抗氧化能力的活性：发现新鲜汽油中三种抗氧化剂的活性明显高于稀释后的精子和解冻后的精子（P <0.01），但三种类型的稀释和解冻精子中的酶活性差异不显着（p> 0.05）。离心去除上清液中的抗氧化酶的情况下，三种酶在冷冻前后的活性没有显着差异（P> 0.05）。此，上述实验结果表明，当在马和驴中制备冷冻精子时，我们可以在稀释液中加入抗氧化酶，这可以补偿抗氧化酶的损失。
　　离心过程中氧化并除去精制的精子，从而改善马和驴的冷冻精液的融化。量之后。理损伤的优化物理损伤主要是由细胞内外冰晶的形成引起的。方面，冰晶会破坏细胞结构，另一方面，局部结冰会改变细胞内的渗透压并破坏细胞[12-13]。细胞冷冻时，冰晶首先在细胞外形成，细胞仍然不能在-10℃以上的细胞中冻结。温度进一步降低时，细胞外冰晶加速形成[12]。未冷冻的水域中，溶质浓度越来越高，这使得细胞内过冷溶液和极其丰富的溶质之间的化学势发生巨大差异。冷却速度缓慢时，细胞外溶液中首次出现冰晶，细胞内外出现化学势差异，导致水分泄漏。胞膜内部和细胞内溶质浓度增加，导致细胞膜和细胞内蛋白质受损。就是说，“溶质损伤”[12-13]，当冷却速度加快时，细胞的内部水分小于外渗，细胞内冰晶网络出现，对细胞膜造成机械损伤[14]。于在冷却过程中种子的温度在0和60℃之间，因此在种子的冷冻过程中必须尽早穿过该危险温度区域以获得令人满意的冷冻效果。理论上讲，冷冻精子从头发和唾液中的最佳冷却速度为36.5°C / min [12]。
　　胞外冰晶的形成极大地改变了细胞所处的溶液的性质。种变化通常被称为“解决方案效应”。原因是在冷冻过程中冰晶与溶质分离。加非电解质（例如甘油）可显着改变溶液的效果。Vidament等。[15]报道，2.2％，3.5％，4.8％的甘油被加入精子冷冻痰中，从而影响了受孕率。们假设甘油可能对蛹的生殖道产生毒性作用。过去两年中，我们的研究团队已经冻结了超过50，000个含有5.9％甘油的精子。2012年，在5个试验点的725只蟑螂和马的繁殖试验中，3例不退货率（设计率为53.11％，相当于新鲜选择的结果和精子质量评估精子质量决定精子样本的选择和原始物种的稀释因子目前对精子质量的评估主要基于精子质量的三个方面。：外观鉴定，活力和生化检查的显微评价痰液起源比马，精子pH值高70％~80％痰= 7.6，与牛和羊精液的pH值6.5和6.9明显不同。节重点介绍精子活力等实验室评估技术，顶体的完整性，线粒体的活性，完整性DNA和精子膜的完整性[5]。完整性的检测质膜是精子的最外层细胞结构，其作为细胞内外的生理屏障并且与正常的生理功能相关。谢，获能，顶体反应，雄性配子和雌性配子。子融合与卵母细胞之间存在直接联系。究表明，精子质膜是最脆弱的部分，其完整性是精子生命和死亡的间接指标。
　　Osinowo等人发明的低渗肿胀试验（HOST）。作要点[16]：用低渗溶液稀释精子，在37℃温育后，将均匀混合的样品加到预热至37℃的载玻片上，在光学显微镜下观察400时间。过低渗肿胀试验关闭完整的精子精子，不完全的膜没有显示出这种现象[28]。粒体活性的检测线粒体是真核生物中氧化代谢的位点，其中糖，脂肪和氨基酸的最终氧化释放能量。粒体活性直接影响精子受精。过用罗丹明123（Rh123）染色可以鉴定精子的线粒体活性。丹明123是能够穿过细胞膜，并且可以颜色线粒体vivantes.Elle细胞的荧光染料是对细胞无毒性，并且可以结合在数分钟内活性线粒体，呈现出黄绿色荧光[ 17。作点[16]：将若丹明123在HEPES / BSA，收集精液样本，并加入到染料若丹明溶液，并将其放置在潮湿，暗处进行30分钟，在37℃ C，然后收集并准备400倍荧光显微镜观察。体完整性测试用异硫氰酸酯和荧光素标记的花生凝集素（FITC-PNA）检测顶体的完整性[18]。作要点[16]：取出涂片，风干，用甲醇固定，在空气中晾干。载玻片浸入FITC-PNA溶液中。
　　载玻片用PBS冲洗，空气中干燥，然后用抗褪色溶液的层，以保护fluorescence.Les载玻片覆盖的荧光显微镜和完整顶体的精子表现出下观察强烈的荧光。DNA完整性测试Evenson和其他研究人员发明并改进了使用染色质结构分析（SCSA）来检测精子DNA的完整性[19-20] 。本原理是受损的DNA在精子冷冻后被分成单股，吖啶橙（AO）可以与双链精子结合，发出绿色荧光作为单体和单链精子作为聚合物排出。色或黄色荧光。测方法[16]：用TNE缓冲液稀释精子样品，用低pH洗涤溶液洗涤30秒，并用吖啶橙染色6分钟。蒸馏水冲洗后，盖上载玻片并在荧光显微镜下观察。DNA的完整精子发出绿色荧光，DNA链断裂或单链DNA发出橙色，黄色和红色荧光。可以通过单细胞凝胶电泳（SCGE）检测DNA完整性测试。细胞凝胶电泳技术由Ostell等人发起，然后由Singh等人开发。[21]。是一种快速检测细胞DNA损伤的实验方法。于它的细胞电泳形式类似于彗星，它也被称为彗星剂量。作点[22]：首先用正常熔点的琼脂糖制备第一层胶水，然后将稀释的精子样品和低熔点琼脂糖涂在第一层胶水上然后分别用裂解物，RNase和蛋白酶K消化。染色，在荧光显微镜下观察400次。DNA切割的细胞形成类似彗星的条带，而精子与DNA完全不同。胡尔等人。
　　[23]使用的SCGE方法分析冷冻精子和在冬季和夏季冷冻前的DNA的完整性，并冷冻后发现，水牛精子高度破坏性的DNA（P <0 ，05）。时，夏季DNA损伤程度明显高于冬季（P <0.05）。Fraser等[40]使用SCGE检测猪精液DNA的完整性，发现冻融可导致精子DNA断裂增加（P <0.05）但与精子采集方法和所使用的冷冻保存类型无关。然很少有关于精子精子冷冻保存的研究，但相关的检测方法尚未在绥中进行报道，但鉴于精子精子的五种检测方法，因此，在人类，牛，猪和其他物种[15，22，24]中，它被认为同样适用于检测痰中的精子储存。其他农场动物相比，人工授精技术的人工授精技术发展相对较慢，主要原因是缺乏生殖记录和排卵机制知识有限。情周期持续约20至40天，品种最多的天23和30之间，发情持续6至9。

　　情之后5〜6天排卵，第二个是，所述认识度不高[25]。工授精在发情周期中需要约2至4次，这与牛的人工授精非常不同。三，马和驴的人工授精过程存在技术障碍，例如狒狒。宫颈通常比母马长，其直径较小[25]。而，马匹和马匹具有一定的经济价值，人工授精技术可以大大降低繁殖成本，减少疾病的传播，提高使用精细遗传物质的效率，并选择最佳时间繁殖等在大规模的繁殖条件下。必要培养一种有效的人工辅助生殖技术[25]。剂量人工授精通常采用深层宫颈授精，使用导管将精子输送到卵巢卵泡发育同侧近端小管的乳突。种方法可有效提高受精率。
　　限数量的精子[27-28]。前，直肠引导（TRG）和宫腔镜深度人工授精（HYS）有两种深度人工授精方法。精深宫腔镜角度使得精确位置授精，但设备是昂贵宫腔镜[29]，和子宫镜检查和相关的膨胀子宫可能导致细菌生长负责子宫内膜炎[30 ]，这也减少怀孕。格。用单个授精管通过直肠引导将精液输送到近端管的乳突可以取代宫腔镜授精方法[31]。03卷张瑞涛等，精子采集和精子冷冻技术操作点研究TRG [16，19]：吸出精子，手动导管通过子宫颈穿过产道，然后从产道取出手臂进入直肠，通过直肠引导输精管卵泡发育在子宫同侧的卵巢上。认从子宫角末端触诊输精管末端并推动注射器将精子慢慢注入子宫腔。出注射器，将3毫升空气吸入输精管，轻轻压入输精管，确保精子完全从输精管中排出。精3分钟后让雄鸡移动。HYS操作要点[29]：类似于直肠引导人工授精技术，柔性内窥镜通过子宫颈放置在产道中。抽出臂插入直肠，并将内窥镜引导通过直肠到卵巢同一侧的子宫角，与卵泡发育相连。子宫角末端充气并推进内窥镜，直到看到输卵管的乳头。输精管进入输卵管附近的乳头，冷库安装所有精子都排入乳头。除输精管，将内窥镜移除到子宫角以从子宫移除空气，最后移除内窥镜。较两种授精方法，Lindsey等[33]估计HYS的妊娠率（5 / 10，50％）高于TRG（0 / 10，0％）， Brinsko及其同事[32]考虑了怀孕率（12 / 18，66％）。）和TRG（10 / 18，56％）两种授精方法在受孕率方面没有显着差异。Lindsey等[34]随后发现HYS（12/22，）和TRG（9/24）两种受精方式对妊娠率的影响不显着。登等人。[29]还发现，当授精次数足够时，两种授精方法对受孕率影响不大，但当授精量为25×106 50×106时，受孕率明显受到影响，因此建议使用冷冻精子。者，使用深角授精方法通过性控制选择精子。
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