到的与对人卵巢组织，体外激素的卵泡生长和分泌的毛囊的形态不同载体玻璃化协议的影响冷冻和解冻后的比较，并搜索人卵巢组织的玻璃化临床简单有效。结计划。法16例卵巢组织切成皮质条并随机分配到新鲜组和载体的不同玻璃化基团，包括冷冻管组，该组小液滴，所述网状基不锈钢和固相表面玻璃化组。各组的卵巢组织的毛囊的形态是observée.Les卵巢组织的冷冻和解冻后在体外进行比较卵泡在培养基中生长和雌二醇浓度和孕酮培养。
　　果冷冻和解冻后各组原始卵泡的正常形态水平均低于新鲜组，差异有统计学意义（p <0.05）。始卵泡形态的标准速率为（64.57±11.84）％，（78.36±7.62）％，（77.21±6.51）％和（84.70±）中冷冻管组，最小液滴组，不锈钢网组和固体表面组。5.03）％。体表面组中原始卵泡的正常形态明显大于其他玻璃化组（p <0.05）。着培养时间的延长，体外培养基中雌二醇和孕酮的平均水平逐渐增加。相表面玻璃化组中两种激素的平均浓度显着高于其他玻璃化组。
　　养后，卵巢组织中原始卵泡的比例相对于新鲜组降低，生长卵泡的比例增加。体表面玻璃化组中生长卵泡的比例显着高于其他玻璃化组。论固体表面的玻璃化可以保持大多数原始卵泡的正常形态，并保持其体外生长和性激素的分泌。技术简单易行，具有良好的冷冻效果。适用于人卵巢组织玻璃化的临床应用。卵巢组织;玻璃化;支持;固相表面玻璃化;在体外培养[分类号] R711 [文献代码] A [编号] 1673-7210（2012）12（b）中-0008-04卵巢组织的冷冻保存可以提供给恢复生育力的选项，并卵巢早衰或癌症需要放疗和化疗的患者的内分泌功能[1]。璃化是近年来发展冷冻的新方法：它直接减少在液氮中冷冻物体的温度，防止冰晶的形成和可以绕过所述组织的各种细胞组分的各种技术组件。而改善冷冻保存的效果。璃化冷却速度直接决定了冷冻保护剂是否能形成玻璃态，所用载体是影响冷却速度的最重要因素。然人类卵巢组织的冷冻保存玻璃化中的应用已有报道，所用的载体是冻存管[2]中，开放稻草[3]的小液滴[4]的方法和不锈钢网[5]。而，最适合人卵巢组织玻璃化的载体需要进一步研究。体表面玻璃化（SSV）是近年来出现的一种简单有效的玻璃化方法。

　　早期使用它成功地玻璃化人类卵巢组织片，我做了一个缓慢的程序。冻的效果就足够了[6]。研究的目的是比较固相表面玻璃化对人卵巢组织玻璃化与其他载体的影响。料和方法收集和卵巢样品收集从2011年11月至2012年6月在纪念医院中山大学大学孙中山，在16例谁接受手术治疗人类卵巢组织样品的前处理腹腔镜或腹腔镜。21至40岁，平均（32.7±5.9）岁，规律的月经史，任何内分泌紊乱，无辐射和化疗的历史，激素不采取任何历史在少于六个月和卵巢囊肿直径< 7厘米。

　　中，良性卵巢囊肿8例，子宫肌瘤5例，宫颈癌3例。有患者均签署知情同意书，该研究经中山大学中山纪念医院伦理委员会批准。巢新鲜组织浸渍在含有10％人抗体双 青色白蛋白的L-15培养基（Gibco），和过量的骨髓从立体显微镜提取并切成约5mm×1皮质mm×1 mm。带被随机分配到不同的实验组：新鲜组（F组），组玻璃化冷冻管（TV组），由小液滴玻璃化组（MDS组），玻璃化组不锈钢网（ SLV组）和固相表面玻璃化组（SSV组）。4％多聚甲醛溶液直接固定新鲜组。璃化和复苏过程使用含有20％乙二醇（EG） 20％二甲基亚砜（DMSO）的L-15溶液作为玻璃化溶液。后卵巢组织浸在玻璃化溶液，在25％C，25％，50％，75％和100％，然后逐渐引入冷冻保护剂，然后用不同的载波玻璃化：电视组放置卵巢在4℃下1mL。液氮加入无菌冷冻管中，进行100％玻璃化;用巴氏灭菌的灭菌管将MDS组直接引入液氮中;将SLV组置于不锈钢筛上并置于液氮中;在SSV组中，将卵巢组织置于预先在液氮中冷却的液氮中，并将卵巢组织收集在冷冻管中并储存在氮气表面下的液氮中。体。复苏期间，将冷冻管从液氮中取出并静置10秒，冷库安装电视组除外，然后置于37℃水浴中2至3分钟以消除卵巢组织。其依次转移至0.5，0.25和0.125mol / L蔗糖溶液中，洗涤并使其在37℃培养箱中静置备用。外培养人卵巢皮层卵巢组织的体外培养[7]。复苏的卵巢组织在整合培养皿Millicell-ORG（Millipore）上生长。养基成分：a-MEM溶液，2.5％人白蛋白，1％亚硒酸钠转铁蛋白胰岛素转铁蛋白ITS（含胰岛素，转铁蛋白和亚硒酸钠），500 mIU / mL重组人卵泡刺激素（rhFSH）和青色双链。
　　养10天后，每2天更换新鲜培养基，并将吸出的培养基用于测定激素。培养结束后，将所有卵巢组织用于组织学测试。石蜡掺入，HE染色后用4％多聚甲醛，4μm连续切片固定卵巢组织的组织学分析，并在光学显微镜下计数所有切片。卵母细胞核标记初级卵泡和初级卵泡计数，并在每个样品中盲法计数原始卵泡和形态正常的初级卵泡。据Gougeon的标准进行卵泡形态的分类和评估[8]。
　　激素和孕酮的测定将置换的培养基收集在无菌EP管中，并在-20℃冰箱中储存。养结束后，测定雌激素和孕酮水平。国自动化学发光免疫分析系统ACS：180SE。计学方法采用SPSS 11.0统计分析软件进行，测量数据以均数±标准差（x±s）表示。用单向ANOVA和χ2检验进行组织学结果的统计分析。
　　过在GLM中重复分析，通过分析变异性的方差来进行培养基中雌二醇和孕酮的测定。异在统计学上显着，p <0.05。果卵巢皮质的组织学分析在冷冻前后组织切片中在光学显微镜下观察正常和锁定的卵泡（图1）。冻和解冻后各组卵巢组织卵泡形态正常率均低于F组（P <0.05）。中，SSV组初级和初级卵泡的正常形态较高（P <0.05），其次是MDS组和SLV组，这两个组之间没有显著差异（P> 0， 05），而TV组卵泡的正常形态最低（P> 0.05）。
　　P <0.05）（表1）。巢组织的体外培养在体外培养10天后，每组的卵巢皮质的边缘是圆形的。存的毛囊见于各组光学显微镜的卵巢皮质，如示于图2如图2所示，与卵巢组织未开垦成本，原始卵泡在卵巢组织的比例相比培养后各组均下降（P <0.05），生长卵泡（包括原发卵泡和继发卵泡）的比例增加。（P <0.05）。始卵泡和卵泡的生长在未开垦新鲜组的比例为85.96％和14.04分别％，电视组60.66％和33.34％的MDS组中56.74％和43.76％，54.76％和45.21％; SSV培养后为46.0％和54.0％。SSV组中的初级卵泡的比例高于在其它冷冻组（P <0.05）和原始卵泡的比例显著更高比其它冷冻组（P <0.05）的显著低。视组中两种类型的卵泡的比例与其他组的比例显着不同（p <0.05）。MDS组和SLV组的两个卵泡组之间没有统计学差异。术重要性（P> 0.05）。超过在体外培养的10天培养基激素的测量结果，在复苏后卵巢组织的培养基中雌二醇和孕酮水平的装置与由所述培养时间逐渐增加相对于新鲜培养基（图3A，3B）。SSV组雌二醇和孕酮的平均浓度显着高于其他组（p <0.05）。视组中两种激素的水平显着低于其他组（p <0.05）。MDS组与SLV组之间无显着性差异（P> 0.05）。论该玻璃化过程需要由载体spécial.Pour卵巢组织输送冷冻保护剂和组织细胞，穿用者需要一定的体积，同时最小化致冷剂以增加速度所需的体积冷却。外，当织物浸入液氮中时，沸腾的氮气包裹织物，由于其低导热性而降低冷却速率，从而形成有效的绝热区[9]。以看出，载体的选择应考虑上述各种决定因素。经将各种基材实验性地应用于玻璃化冷冻过程，例如冷冻管，开口细长稻草[10]，最小微滴和不锈钢网。冻管应用于卵巢组织的程序性冷冻，但由于厚壁和需要更多冷冻液体，冷却速度慢，不能满足玻璃化的需要。这项研究中，冷冻管玻璃化冷冻组的正常形态仅为64.57％，冷冻保存效果显着低于其他组。Yeoman等[4]采用微滴直接方法对猴子的卵巢组织进行玻璃化处理。温后，约70.4％的卵泡保持其正常的形态。这项研究中，也被用于玻璃化的卵巢组织humain.Après重新升温的方法中，形态学检查表明，原始卵泡的约78.36％保持正常的形态，冷库安装低于成本组SSV组，体外培养后，卵泡生长的比例增加。而，它仍然低于新鲜组和SSV组，表明微滴的直接玻璃化对卵巢组织中原始卵泡的形态和发育潜力有影响。面玻璃化固相是一种技术，简单和有效的玻璃化，近年来出现的：它已被成功地用于冷冻釉牛[11]成熟卵母细胞和羊的卵巢组织[12]与上述载体相比，SSV方法具有独特的优点：首先，因为溶液直接将组织置于固体表面上，该表面已经半悬浮在液氮中，温度为-150℃。-180°C，可以避免。氮的蒸发会产生气泡导致的热传导阻塞[13];其次，SSV技术具有更大的与液氮相对接触的面积，并且可以最小化冷冻组织所需的冷冻保护剂，从而提高冷却速度并有利于玻璃。成[12]。三，该方法的应用可以冻结大量的卵巢组织，可以在短时间内完成大量卵巢皮质的冷冻保存。四，在ISS方法，由于玻璃状液滴加载织物在37℃直接浸入温热的溶液中，温度可以被快速加热，以防止冰晶的形成和减少损坏组织细胞。前在SSV方法中使用的预冷固相表面材料主要被描述为铝箔，主要是因为铝箔具有优异的导热性和延展性，价格便宜并且易于处理。者是第一个使用SSV技术保存人类卵巢组织的人，并证实其冷冻效果可与传统的程序性冷冻相媲美。这项研究中，SSV与其他载体（冷冻管，最小微滴方法和不锈钢网）进行比较，以研究卵泡形态，体外生长能力和解冻后卵巢组织中的激素分泌功能。果表明，在解冻后，原始卵泡ISS组保留了正常形态的大约84.70％，虽然比新鲜卵巢组织（约90.27％）的正常形态略低，但70％的与其他出版物相比，冻结后90％。始卵泡的正常形态大致相当[14-15]。冻 - 解冻卵巢组织培养物中原始卵泡的比例低于未培养的新鲜组，并且生长卵泡的比例增加。ISS组中生长卵泡的比例比其他玻璃化组显著更高，以及雌二醇和孕酮的在培养基中的平均浓度也比其他组的玻璃化更高。证明SSV技术优于冷冻管，最小液滴法和用作支撑物的不锈钢网，并且更适合于人卵巢组织的有效玻璃化。
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