以传统的慢速冷冻方法为对照，研究了玻璃化冷冻保存对体外受精绵羊胚泡保存的影响。于体外受精绵羊囊胚，有两个囊胚冷冻方法之间生存率无显著差异，但玻化组的囊胚率比慢冻组显著较高（分别为76.8％和41.0％，P <0.05）。植冷冻解冻胚泡后，玻璃化组的妊娠率和产羔率明显高于慢速冷冻法。时，比较了不同时间培养后体外受精胚泡玻璃化和冷冻保存对绵羊的影响。胚2个小时或5小时取样和存活率和胚胎的胚泡孵化冷冻和解冻后比对照组显著率越高后（75.0％培养分别为50.0％，78.8％，69.7％，41.2％，26.5％）。<0.05）。养10小时后，冷冻和解冻后孵化时胚泡胚的存活率和速率降低。果表明，玻璃化方法可用于冻结体外受精胚泡和切blastocystes.Les绵羊受精胚泡和échantillonnés.Après2〜5小时恢复，防冻液容量可以改善。;体外受精胚泡;慢慢冷冻;玻璃化;细胞取样中图分类号：S826; S814.6文献标识码：A文章编号：0439-8114（2008）05-0503-03Etude玻璃化冷冻试管婴儿羊BlastocystZHANG xin1，2佳，杨Mei2，牛志红2，史红CAI2，郭志qin2（1.动物遗传学，繁殖育种，农业内蒙古大学重点实验室，呼和浩特010018;中国生物技术重点实验室，农业，新疆畜牧科学院，乌鲁木齐830000部，中国）总结：玻璃化组和慢速冷冻组囊胚的存活率相似，但孵化囊胚的发生率相似。胎移植后，玻璃化组的妊娠率和产羔率均高于慢速冷冻组。囊胚玻璃化biospiés二两种文化后，存活率和囊胚孵出率分别比对照（75.0％，50.0％，冷库安装78.8％，69更高分别为7％和41.2％，26.5％，p <0.05）。活率和孵出囊胚率10小时成功培养胚泡biospié.En结论，羊囊胚IVF和囊胚可以被玻璃化biospiés后降低，囊胚的玻璃化得到改善biospiés培养2~5小时后.Motif：绵羊;慢慢冷冻;玻璃化;从胚胎活检的动物的冷冻保存是一个重要的生物技术，不仅在低温生物学的基础研究，同时也为促进实际生产和动物胚胎的营销。传统的慢速冷冻相比，玻璃化具有操作简单，冷冻效率高的优点[1，2]。然羊胚胎玻璃化也取得了成果[3-5]，已报道受精胚胎玻璃化冷冻体外，显微操作后，特别是体外受精胚胎的少数病例。期对胚胎遗传物质的分析需要采样，主要是从胚胎中取出一些细胞进行检测。样过程对新鲜胚胎的生存能力没有影响，但冷冻后冷冻胚胎的发育能力降低[6]。们曾经在低速冷冻作为证人来检查玻璃化和受精卵在体外和解冻效果transplantation.En同时囊胚后冷冻保存的效果，我们比较后不同的培养时间后的玻璃受体胚泡的体外微量取样。存凝胶的效果。为体外受精胚胎的相关研究和应用提供了基础数据。
料和方法卵母细胞收集和体外成熟卵巢取自刚刚在屠宰场屠宰的绵羊，并在3小时内返回实验室。所建立的超洁净，卵母细胞从卵泡收集具有直径为2〜5mm的卵巢的表面上，并将含有层完整卵丘细胞和均匀的细胞质中的卵母细胞在显微镜下选择。选择的卵母细胞成熟的溶液洗涤三次，并15层的卵母细胞置于50升成熟液滴和培养在培养箱中在38.6℃，5％CO 2，饱和湿度24〜 26小时。熟的解决方案包括TCM1999的（Sigma公司） 10％FBS（Hyclone）的3.6微克·ML-1 6·微克ML-1 LH FSH（中国科学院学报）（学院中国科学）女性乙二醇（Sigma） 1μg·mL-1。净化台上将IVF打开新鲜睾丸，切附睾的尾部，放置在流体SOFM基本受精件，放在悬挂在培养箱中在39℃下进行30至50分钟，然后将它们转移到10 mL管中。子悬浮液用自组织特征映射（5分钟，1500转/分）洗涤两次，然后将精子再悬浮与受精（SOFM 20％绵羊血清），并在38.6孵育°C 30分钟。此同时，成熟的卵母细胞进行洗涤，反复冲洗在含有0.05％透明质酸酶（Sigma）的以除去卵丘细胞的一部分的溶液中，并且选择的卵丘细胞的2〜3层。受精溶液洗涤卵母细胞三次后，15-20成熟的卵母细胞分别置于在50μl受精液，并温育的精子加入到5×106精子·ml-1的并置于CO 2培养箱。化。受精卵体外培养20小时后，用培养基将受精卵洗涤三次，并用移液管反复吸出以除去多余的精子，10-15将受精卵转移至50μL培养液滴中。
养培养基组成SOFM 1％NEAA的（Gibco）中EAA（Gibco）中的 1％ 1谷氨酰胺毫摩尔（Sigma公司） 5 U·ml-1的胰岛素（Sigma公司） 3·毫克毫升-1 BSA（西格玛）。精后48小时，将受精卵转移到含有10％牦牛血清的培养基中。48小时更换2/3的培养基，观察液体变化过程中胚胎的发育情况。体外受精后第7天检查每个测试组的胚胎发育。
样胚胎并用处理溶液洗涤两次后，转移20μL处理液滴，处理溶液为无钙和镁的SOFM溶液，补充7.5μg·mL-细胞松弛素B.吸取7-8细胞的显微采样后胚胎的1，将胚与培养基洗涤3次，然后转移到培养液滴和在CO 2培养箱中冷冻根据实验方案，在不同的时间。胎缓慢冷冻：使用DPBS作为基液，加入3mg·mL-1 BSA，1.8mol乙二醇和0.05mol海藻糖。胚胎在室温（25℃）下置于冰箱中5分钟，然后置于0.25ml细管中，将管置于冰箱中。后开始冷冻程序并从0℃降至1℃·min -1至-6.7℃并在冰后平衡10分钟。
后将其降至-30℃至0.3℃·min -1并直接储存在液氮中。冻后，从液氮中取出细管，在空气中放置5秒钟，然后置于37℃水浴中10秒钟，然后将胚胎转移到培养液用培养液洗涤三次，然后滴入培养液中。续培养48小时，观察胚胎的发育。璃化：所有玻璃化的基本溶液是DPBS补充有0.3mmol丙酮酸钠和3.3mmol葡萄糖。室温（25℃），将胚转移到剩余的溶液1（基础溶液 10％血清 10％甘油）中进行5分钟，然后在2（基础溶液 10％的剩余的溶液血清 10％甘油 20％）。衡在乙二醇5分钟），然后直接在玻璃化溶液转移胚胎（VS，基础溶液 10％血清 25％甘油 25％乙二醇），并把它在液氮。冻后，从液氮中取出细管，在37℃的水浴中解冻10秒钟，将细管中的胚胎排出到0.5mol蔗糖溶液中，快速取出胚胎并转移到0.25摩尔蔗糖溶液中5分钟。培养基洗涤胚胎3次，培养2小时，观察胚胎恢复。件人母羊同时处理，并用阴道孕酮海绵处理12 jours.Avant松开，每只羊接收2氯前列醇的肌肉内注射和400 IU PMSG的。那之后，冷库安装每天早上和晚上使用测试公羊尝试直到发情。
2表明，玻璃化胚泡的体外受精和冷冻解冻羊有一个怀孕率和更高显著产羔率比缓慢冷冻组（P <0.05，52.3％，分别为34.1％和27.8％）。11.1％）。3表明，由绵羊受精体外胚泡培养2小时或5小时，生存率和囊胚冷冻和解冻后胚胎孵化的速率比对照组的高显著（分别为75.0％，50.0％，78.8％，69.7）。％和41.2％，26.5％，p <0.05）。养10小时后，冷冻和解冻后孵化时的存活和胚泡胚胎水平降低，但差异不显着。结和讨论玻璃化是指利用物理学将高浓度的冷冻保护剂从液体快速冷却到稳定，透明的无定形固态玻璃体[1]。璃化状态可以防止冰晶的形成。报道玻璃化可以减少对低温胚胎的损害，如细胞内脂滴损伤和细胞膜，以及细胞骨架受损，从而提高冷冻后胚胎的活力[7]。外受精胚胎含有高比例的脂质，这使得它们对低温的影响更敏感[8]。前，慢速冷冻方法仍然是国际上使用的胚胎冷冻方法。
而，在缓慢冷冻过程中，由于温度下降较慢，冰晶更容易在胚胎中形成，这增加了对高等级体外受精胚胎的损害。脂质。璃化使用高浓度的冷冻剂和快速冷却速率，这在一定程度上防止了冰晶的形成以及由此对体外受精胚胎造成的损害。实验的结果表明，可行的囊胚的孵化率，移植后和产仔妊娠率均较缓慢冷冻方法的显著更高囊胚的冷冻保存后体外受精玻璃化。
们的研究结果表明，IVF囊胚后，文化可以显著增加（2到下午5点），它可以显著改善冻融阻力，但长期培养会降低成活率冷冻和解冻后。与之前的报道类似，冷冻前的长期培养导致牛胚胎对冷冻的抵抗力下降[11，12]。之，玻璃化的应用有助于获得切割和échantillonnage.AprèsIVF后囊胚体外和冷冻羊囊胚受精囊胚，绵羊可以提高2后，他们的能力霜在5小时恢复培养。
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